एक सरल गड्ढे परख प्रोटोकॉल की कल्पना करने के लिए और विट्रो में ओस्टियोक्लास्टिक अवशोषण की मात्रा निर्धारित करने के लिए
Summary
यहाँ, हम कैल्शियम फॉस्फेट लेपित सेल संस्कृति प्लेटों का उपयोग कर अवशोषण गड्ढे assays के लिए एक सरल और प्रभावी परख प्रक्रिया पेश करते हैं।
Abstract
परिपक्व ऑस्टियोक्लास्ट्स मल्टीन्यूक्लिएटेड कोशिकाएं हैं जो एसिड और एंजाइमों के स्राव के माध्यम से हड्डी को नीचा दिखा सकती हैं। वे विभिन्न बीमारियों (जैसे, ऑस्टियोपोरोसिस और हड्डी के कैंसर) में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और इसलिए अनुसंधान की महत्वपूर्ण वस्तुएं हैं। इन विट्रो में, उनकी गतिविधि का विश्लेषण अवशोषण गड्ढों के गठन से किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम कैल्शियम फॉस्फेट (CaP) लेपित सेल संस्कृति प्लेटों का उपयोग करके एक साधारण गड्ढे परख विधि का वर्णन करते हैं, जिसे आसानी से कल्पना और परिमाणित किया जा सकता है। मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) से व्युत्पन्न ऑस्टियोक्लास्ट अग्रदूतों को ओस्टियोक्लास्टोजेनिक उत्तेजनाओं की उपस्थिति में लेपित प्लेटों पर सुसंस्कृत किया गया था। इनक्यूबेशन के 9 दिनों के बाद, ओस्टियोक्लास्ट्स को तय किया गया था और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए दाग दिया गया था, जबकि सीएपी कोटिंग को कैल्सीन द्वारा काउंटर दाग दिया गया था। रिसॉर्ब किए गए क्षेत्र को मापने के लिए, प्लेटों पर CaP कोटिंग को 5% AgNO3 के साथ दाग दिया गया था और ब्राइटफील्ड इमेजिंग द्वारा कल्पना की गई थी। अवशोषण गड्ढे क्षेत्र ImageJ का उपयोग कर परिमाणित किया गया था।
Introduction
ओस्टियोक्लास्ट (ओसी) हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) से व्युत्पन्न ऊतक-विशिष्ट मैक्रोफेज हैं, जो ओस्टियोब्लास्ट्स1 के साथ हड्डी के रीमॉडलिंग में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सेक्स हार्मोन-प्रेरित, प्रतिरक्षाविज्ञानी, और घातक हड्डी विकार जो हड्डी को व्यवस्थित रूप से या स्थानीय रूप से नष्ट करते हैं, रजोनिवृत्ति से संबंधित ऑस्टियोपोरोसिस2, संधिशोथ3, पीरियडोंटल रोग4, मायलोमा हड्डी रोग5, और ऑस्टियोलाइटिक हड्डी मेटास्टेसिस6 सहित अतिरिक्त ओस्टियोक्लास्टिक गतिविधि के कारण होते हैं। इसके विपरीत, ओसी गठन और कार्य में दोष भी ओस्टियोपेट्रोसिस7 का कारण बन सकते हैं। एचएससी मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ, जीन प्रतीक एसीपी 5) उत्तेजना के तहत ओसी पूर्वजों में भेदभाव से गुजरते हैं। M-CSF और NF-πB लिगैंड (RANKL, जीन प्रतीक TNFSF11) के रिसेप्टर उत्प्रेरक दोनों की उपस्थिति में, OC पूर्वज मोनोन्यूक्लियर OCs में आगे अंतर करते हैं और बाद में multinucleated OCs 8,9,10 बनने के लिए फ्यूज करते हैं। दोनों साइटोकिन्स M-CSF और RANKL ऑस्टियोक्लास्टिक मार्करों जैसे कैल्सिटोनिन रिसेप्टर (सीटी), परमाणु कारक के रिसेप्टर एक्टिवेटर के प्रेरण के लिए अपरिहार्य और पर्याप्त हैं, बी (RANK), प्रोटॉन पंप V-ATPase, क्लोराइड चैनल 7 अल्फा सबयूनिट (CIC-7), इंटीग्रिन π3, टार्टरेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप, जीन प्रतीक ACP5), लाइसोसोमल सिस्टीन प्रोटीज कैथेप्सिन K (CTSK), और मैट्रिक्स मेटालोपेप्टिडेज 9 (एमएमपी 9)। सक्रिय OCs एकरफ़ल्ड सीमा 11,12 के साथ एक एक्टिन अंगूठी के गठन के माध्यम से हड्डी की सतह पर एक सीलिंग क्षेत्र बनाते हैं। सीलिंग ज़ोन के भीतर, OCs प्रोटॉन पंप V-ATPase12,13, MMP9 14, और CTSK15 के माध्यम से प्रोटॉनस्रावित करने के माध्यम से अवशोषण की मध्यस्थता करते हैं, जिससे लैकुने का निर्माण होता है।
इन विट्रो प्रयोगों के लिए, ओसी पूर्वजों को चूहों के फीमर और टिबिया16,17 से अस्थि मज्जा मैक्रोफेज के विस्तार के साथ-साथ रक्त के नमूनों और बफी कोट18,19,20 से मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) के अलगाव द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, या अमर मूरीन मोनोसाइटिक कोशिकाओं के भेदभाव द्वारा रॉ 264.7 21,22।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम प्राथमिक PBMCs से व्युत्पन्न OCs का उपयोग कर CaP लेपित सेल संस्कृति प्लेटों में एक osteoclastic अवशोषण परख का वर्णन करते हैं। यहां उपयोग की जाने वाली CaP लेपित सेल संस्कृति प्लेटों की विधि को अपनाया जाता है और Patntirapong et al.17 और Maria et al.21 द्वारा पहले वर्णित विधि से परिष्कृत किया जाता है। OC अग्रदूतों को प्राप्त करने के लिए, PBMCs को घनत्व ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया जाता है और पहले20 वर्णित के रूप में विस्तारित किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम एक osteoclastic अवशोषण परख के लिए एक सरल और विश्वसनीय विधि का वर्णन OCs व्युत्पन्न और PBMCs से विट्रो में विस्तारित का उपयोग कर. उपयोग किए गए सीएपी लेपित सेल संस्कृति प्लेटों को आसानी से तैयार किया जा सकता…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को आंशिक रूप से चीन छात्रवृत्ति परिषद [सीएससी नंबर 201808440394] द्वारा वित्त पोषित किया गया था। W.C. को CSC द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
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