インビトロで破骨細胞再吸収を可視化および定量するためのシンプルなピットアッセイプロトコル
Summary
ここでは、リン酸カルシウムコーティング細胞培養プレートを用いた再吸収ピットアッセイのための簡単で効果的なアッセイ手順を提示する。
Abstract
成熟破骨細胞は、酸および酵素の分泌を介して骨を分解することができる多核細胞である。それらは様々な疾患(例えば、骨粗鬆症および骨癌)において重要な役割を果たし、したがって重要な研究対象である。 インビトロで、それらの活性は、再吸収ピットの形成によって分析することができる。このプロトコールでは、容易に可視化および定量化できるリン酸カルシウム(CaP)コーティング細胞培養プレートを用いた簡易ピットアッセイ法について記載する。ヒト末梢血単核球由来の破骨細胞前駆体(PBMC)を、破骨細胞形成刺激の存在下でコーティングプレート上で培養した。9日間のインキュベーション後、破骨細胞を固定し、蛍光イメージングのために染色し、一方、CaPコーティングをカルセインによって対比染色した。再吸収領域を定量化するために、プレート上のCaPコーティングを5%AgNO3 で染色し、明視野画像によって可視化した。再吸収ピット面積をImageJを用いて定量した。
Introduction
破骨細胞(OC)は、造血幹細胞(HSC)に由来する組織特異的マクロファージであり、骨芽細胞1とともに骨リモデリングにおいて極めて重要な役割を果たしている。骨を全身的または局所的に破壊する性ホルモン誘発性、免疫学的、および悪性骨障害は、閉経関連骨粗鬆症2、関節リウマチ3、歯周病4、骨髄腫骨疾患5、および骨溶解性骨転移6を含む過剰な破骨活動によるものである。対照的に、OC形成および機能の欠陥もまた、骨ペトロシス7を引き起こし得る。HSCは、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、遺伝子記号ACP5)刺激下でOC前駆細胞に分化する。M−CSFおよびNF−κBリガンドの受容体アクチベーター(RANKL、遺伝子記号TNFSF11)の両方の存在下で、OC前駆細胞はさらに単核OCに分化し、続いて融合して多核OC8、9、10になる。サイトカインM-CSFおよびRANKLはいずれも、カルシトニン受容体(CT)、核因子κBの受容体活性化剤(RANK)、プロトンポンプV-ATPase、塩化物チャネル7αサブユニット(CIC-7)、インテグリンβ3、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP、遺伝子記号ACP5)、リソソームシステインプロテアーゼカテプシンK(CTSK)、およびマトリックスメタロペプチダーゼ9(MMP9)などの破骨細胞形成マーカーの誘導に不可欠かつ十分である。活性化されたOCは、フリル状の境界11、12を有するアクチンリングの形成を介して骨表面上にシーリングゾーンを形成する。シーリングゾーン内では、OCはプロトンポンプV-ATPase12、13、MMP914、およびCTSK 15を介してプロトンを分泌することによって再吸収を媒介し、ラクナの形成につながる。
インビトロ実験の場合、OC前駆細胞は、マウスの大腿骨および脛骨16,17からの骨髄マクロファージの拡張、ならびに血液試料およびバフィーコート18,19,20からのヒト末梢血単核球(PBMC)の単離によって、または不死化マウス単球細胞RAW 264.7 21,22の分化によって得ることができる。
本プロトコールにおいて、我々は、初代PBMCに由来するOCsを用いたCaPコーティング細胞培養プレートにおける破骨細胞再吸収アッセイを記載する。ここで用いたCaP被覆細胞培養プレート法は、Patntirapongら17 およびMaria et al.21によって以前に記載された方法から採用され、洗練されている。OC前駆体を得るために、PBMCsを密度勾配遠心分離によって単離し、先に記載したように20に拡大する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、PBMCsから インビトロで 誘導および拡張されたOCsを用いた破骨細胞再吸収アッセイのための簡単で信頼性の高い方法を説明する。使用されるCaPコーティング細胞培養プレートは、ラボで利用可能な材料を使用して簡単に調製および視覚化することができます。このプロトコールで採用された未選別PBMCに加えて、マウス単球細胞21 および骨髄マクロファージ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国奨学金評議会[CSC No. 201808440394]によって部分的に資金提供されました。W.C.はCSCから資金提供を受けた。
Materials
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
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