En enkel pitanalyseprotokoll for å visualisere og kvantifisere osteoklastisk resorpsjon i Vitro
Summary
Her presenterer vi en enkel og effektiv analyseprosedyre for resorpsjonsgropanalyser ved hjelp av kalsiumfosfatbelagte cellekulturplater.
Abstract
Eldre osteoklaster er multinukleerte celler som kan forringe bein gjennom sekresjon av syrer og enzymer. De spiller en avgjørende rolle i ulike sykdommer (f.eks. osteoporose og beinkreft) og er derfor viktige forskningsobjekter. In vitro, deres aktivitet kan analyseres ved dannelsen av resorpsjonsgraver. I denne protokollen beskriver vi en enkel pitanalysemetode ved hjelp av kalsiumfosfat (CaP) belagte cellekulturplater, som lett kan visualiseres og kvantifiseres. Osteoklastforløpere avledet fra humane perifere blodmonykleære celler (PBMCer) ble dyrket på de belagte platene i nærvær av osteoklastogene stimuli. Etter 9 dager med inkubasjon ble osteoklaster festet og farget for fluorescensavbildning mens CaP-belegget ble motvirket av calcein. For å kvantifisere det resorberte området ble CaP-belegget på plater farget med 5% AgNO3 og visualisert av brightfield imaging. Resorpsjonsgropområdet ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ.
Introduction
Osteoklaster (OCs) er vevsspesifikke makrofager avledet fra hematopoietiske stamceller (HSC), som spiller en sentral rolle i beinoppussing sammen med osteoblaster1. Kjønnshormoninduserte, immunologiske og ondartede bensykdommer som ødelegger bein systemisk eller lokalt skyldes overflødig osteoklastisk aktivitet, inkludert overgangsalderrelatert osteoporose2, revmatoid artritt3, periodontal sykdom4, myeloma bensykdom5 og osteolytisk benmetastase6. I motsetning kan defekter i OC-dannelse og funksjon også forårsake osteopetrose7. HSC gjennomgår differensiering i OC-forfedre under makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF, gensymbol ACP5) stimulering. I nærvær av både M-CSF og reseptoraktivator av NF-κB ligand (RANKL, gensymbol TNFSF11), skiller OC-forfedre seg lenger inn i mononukleære OCer og smelter deretter sammen for å bli multinukleerte OCer 8,9,10. Både cytokiner M-CSF og RANKL er uunnværlige og tilstrekkelige for induksjon av osteoklastiske markører som calcitoninreseptor (CT), reseptoraktivator av kjernefysisk faktor κ B (RANK), protonpumpe V-ATPase, kloridkanal 7 alfaunderenhet (CIC-7), integrin β3, tartratresistent syrefosfatase (TRAP, gensymbol ACP5), lysosomal cysteinproteasekatepiks K (CTSK) og matrisemetalllopeptidase 9 (MMP9). Aktiverte OCer danner en tetningssone på beinoverflaten gjennom dannelsen av en aktinring med en ruffled grense11,12. Innenfor tetningssonen formidler OCs resorpsjon gjennom utskillelse av protoner via protonpumpen V-ATPase12,13, MMP914 og CTSK15, noe som fører til dannelse av lacunae.
For in vitro-eksperimenter, OC-forfedre kan oppnås ved utvidelse av benmargsmakrofager fra musenes lårben og tibia16,17, samt ved isolering av humane perifere blodmonykleære celler (PBMCer) fra blodprøver og buffy strøk 18,19,20, eller ved differensiering av de udødelige murinmonytiske cellene RAW 264.7 21,22.
I den nåværende protokollen beskriver vi en osteoklastisk resorpsjonsanalyse i CaP-belagte cellekulturplater ved hjelp av OCer avledet fra primære PBMCer. CaP-belagte cellekulturplater metoden som brukes her er vedtatt og raffinert fra metoden beskrevet tidligere av Patntirapong et al.17 og Maria et al.21. For å oppnå OC-forløpere isoleres PBMCer av tetthetsgraderingssentrifugering og utvides som beskrevet tidligere20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en enkel og pålitelig metode for en osteoklastisk resorpsjonsanalyse ved hjelp av OCer avledet og utvidet in vitro fra PBMCer. De brukte CaP-belagte cellekulturplatene kan enkelt tilberedes og visualiseres ved hjelp av lab-tilgjengelige materialer. I tillegg til usorterte PBMCer vedtatt i denne protokollen, har OCer generert fra murine monocytiske celler21 og benmargsmakrofagceller17 også blitt dyrket på lignende syntetiske substrater for pitana…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis finansiert av China Scholarship Council [CSC No. 201808440394]. W.C. ble finansiert av CSC.
Materials
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
References
- Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
- Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
- Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
- Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
- Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
- Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
- Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
- Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8 (2018).
- Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
- Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
- Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
- Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).
- Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
- Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
- Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
- Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578 (2021).
- Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
- Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
- Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
- Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
- Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
- Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).
