Burada, kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakaları kullanılarak rezorpsiyon çukuru testleri için basit ve etkili bir tahlil prosedürü sunuyoruz.
Olgun osteoklastlar, asit ve enzimlerin salgılanması yoluyla kemiği parçalayabilen çok çekirdekli hücrelerdir. Çeşitli hastalıklarda (örneğin, osteoporoz ve kemik kanseri) çok önemli bir rol oynarlar ve bu nedenle önemli araştırma nesneleridirler. In vitro, aktiviteleri rezorpsiyon çukurlarının oluşumu ile analiz edilebilir. Bu protokolde, kolayca görselleştirilebilen ve nicelleştirilebilen kalsiyum fosfat (CaP) kaplı hücre kültürü plakalarını kullanan basit bir çukur testi yöntemi tanımlamaktayız. İnsan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC’ler) türetilen osteoklast öncülleri, osteoklastojenik uyaranların varlığında kaplanmış plakalar üzerinde kültüre alındı. 9 günlük inkübasyondan sonra, osteoklastlar floresan görüntüleme için sabitlendi ve boyanırken, CaP kaplaması kalsein ile karşı boyandı. Emilen alanı ölçmek için, plakalar üzerindeki CaP kaplama% 5AgNO3 ile boyandı ve parlak alan görüntüleme ile görselleştirildi. Rezorpsiyon çukuru alanı ImageJ kullanılarak ölçüldü.
Osteoklastlar (OC’ler), hematopoetik kök hücrelerden (HSC’ler) türetilen ve osteoblastlarla birlikte kemik yeniden şekillenmesinde önemli bir rol oynayan dokuya özgü makrofajlardır1. Kemiği sistemik veya lokal olarak tahrip eden cinsiyet hormonuna bağlı, immünolojik ve malign kemik bozuklukları, menopoza bağlı osteoporoz2, romatoid artrit3, periodontal hastalık4, miyelom kemik hastalığı5 ve osteolitik kemik metastazı6 dahil olmak üzere aşırı osteoklastik aktiviteye bağlıdır. Buna karşılık, OC oluşumu ve fonksiyonundaki kusurlar da osteopetroz7’ye neden olabilir. HSC’ler, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF, gen sembolü ACP5) stimülasyonu altında OC progenitörlerine farklılaşır. Hem M-CSF hem de NF-κB ligandının reseptör aktivatörü varlığında (RANKL, gen sembolü TNFSF11), OC progenitörleri mononükleer OC’lere daha da farklılaşır ve daha sonra çok çekirdekli OC’ler 8,9,10 olmak üzere kaynaşır. Hem sitokinler M-CSF hem de RANKL, kalsitonin reseptörü (BT), nükleer faktör κ B (RANK) reseptör aktivatörü, proton pompası V-ATPaz, klorür kanalı 7 alfa alt birimi (CIC-7), integrin β3, tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP, gen sembolü ACP5), lizozomal sistein proteaz kathepsin K (CTSK) ve matriks metallopeptidaz 9 (MMP9) gibi osteoklastik belirteçlerin indüksiyonu için vazgeçilmez ve yeterlidir. Aktif OC’ler,11,12 numaralı fırfırlı bir aktin halkasının oluşumu yoluyla kemik yüzeyinde bir sızdırmazlık bölgesi oluşturur. Sızdırmazlık bölgesi içinde, OC’ler proton pompası V-ATPaz 12,13, MMP914 ve CTSK15 aracılığıyla protonları salgılayarak rezorpsiyona aracılık eder ve lakuna oluşumuna yol açar.
In vitro deneyler için, OC progenitörleri, kemik iliği makrofajlarının farelerin femurundan ve tibia 16,17’den genişlemesinin yanı sıra, insan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC’ler) kan örneklerinden ve kabarık ceketlerden18,19,20’den izole edilmesiyle veya ölümsüzleştirilmiş murin monositik hücrelerinin farklılaştırılmasıyla elde edilebilir.
Bu protokolde, birincil PBMC’lerden türetilen OC’leri kullanarak CaP kaplı hücre kültürü plakalarında osteoklastik rezorpsiyon testini tanımladık. Burada kullanılan CaP kaplı hücre kültürü plakaları yöntemi, daha önce Patntirapong ve ark.17 ve Maria ve ark.21 tarafından açıklanan yöntemden uyarlanmış ve rafine edilmiştir. OC öncüllerini elde etmek için, PBMC’ler yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile izole edilir ve daha önce açıklandığı gibigenişletilir 20.
Burada, PBMC’lerden in vitro olarak türetilen ve genişletilen OC’leri kullanarak osteoklastik rezorpsiyon testi için basit ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Kullanılan CaP kaplamalı hücre kültürü plakaları, laboratuvarda bulunan malzemeler kullanılarak kolayca hazırlanabilir ve görselleştirilebilir. Bu protokolde benimsenen sıralanmamış PBMC’lere ek olarak, murin monositik hücreler21 ve kemik iliği makrofaj hücreleri17’den üretilen OC’ler…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma kısmen Çin Burs Konseyi [CSC No. 201808440394] tarafından finanse edilmiştir. W.C. CSC tarafından finanse edildi.
AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |