Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Embryo Rescue Protocol til interspecifik hybridisering i squash

Published: September 12, 2022 doi: 10.3791/64071
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1UF/IFAS Tropical Research and Education Center

Summary

Artiklen beskriver en embryo redningsprotokol til regenerering af umodne embryoner afledt af den interspecifikke hybridisering af Cucurbita pepo og Cucurbita moschata. Protokollen kan let replikeres og vil være en vigtig ressource for squashavlsprogrammer.

Abstract

Interspecifik hybridisering i Cucurbita-afgrøder (squash) er ønskelig for at udvide genetisk variation og for introduktion af nyttige alleler. Umodne embryoner, der genereres fra disse brede kryds, skal regenereres ved hjælp af passende embryoredningsteknikker. Selvom denne teknik er veletableret for mange afgrøder, mangler der en detaljeret beskrivelse af den passende metode til squash, der ville tillade rutinemæssig anvendelse. Her beskriver vi en embryo redningsprotokol, der er nyttig til interspecifik hybridisering af C. pepo og C . moschata. For at identificere levedygtige kombinationer til embryoredning blev der udført 24 interspecifikke kryds. Frugtsæt blev opnået fra toogtyve kryds, hvilket indikerer en succesrate på 92%. Imidlertid var de fleste af de opnåede frugter parthenocarpic, med frø uden embryoner (tomme frø). Kun en krydskombination indeholdt umodne embryoner, der kunne regenereres ved hjælp af basale plantevækstmedier. I alt 10 embryoner blev reddet fra den interspecifikke F1 frugt, og succesraten for embryo redning var 80%. Embryo redningsprotokollen udviklet her vil være nyttig til interspecifik hybridisering i squashavlsprogrammer.

Introduction

Cucurbita (2n = 40) er en meget forskelligartet slægt i Cucurbitaceae-familien, der indeholder 27 forskellige arter, hvoraf fem er tæmmet1. Blandt disse er Cucurbita moschata, C. pepo og C. maxima de økonomisk vigtigste på verdensplan. I USA er C. moschata og C. pepo de to vigtigste arter i landbrugsproduktionen. C. pepo består af fire underarter (ovifera, pepo, broderlig og gumala), der indeholder både sommer og vinter squash kultivar grupper af crookneck, straightneck, agern, kammusling, cocozelle, vegetabilsk marv, courgette og græskar 2,3,4,5. C. moschata består primært af vinter squash markedstyper, herunder butternut, Dickinson og ost gruppe1. De to arter er morfologisk og fænotypisk forskellige, med C. pepo betragtet for sit udbytte, earliness, bush vækst vane og forskellige frugtegenskaber, herunder frugtform, frugtstørrelse, kødfarve og skorpe mønster. På den anden side er C. moschata værdsat for sin tilpasning til varme og fugtighed samt sygdoms- og skadedyrsresistens 6,7. Interspecifik hybridisering mellem C. moschata og C. pepo er ikke kun en vigtig strategi for introgression af ønskelige egenskaber mellem de to arter, men giver også mulighed for udvidelse af den genetiske base i avlsprogrammer 7,8.

Tidlige krydsninger mellem C. moschata og C. pepo blev foretaget for at bestemme deres kompatibilitet og / eller taksonomiske barrierer 9,10,11, mens senere undersøgelser hovedsagelig fokuserede på at overføre ønskelige træk12,13,14. Interspecifik hybridisering mellem de to arter har målrettet overførslen af nye træk såsom en busk- eller halvbuskvækstvane og forbedret udbytte fra C. pepo sammen med sygdomsresistens, tilpasningsevne til abiotisk stress og øget kraft fra C. moschata14,15,16. For eksempel har specifikke krydsninger mellem C. pepo (P5) og C. moschata (MO3) resulteret i højere frugtudbytte 13, mens C. moschata-tiltrædelser (nigeriansk lokal og Menina) er blevet anvendt i vid udstrækning som den primære kilde til resistens over for potyvirus i dyrkede C. pepo-sorter 17,18.

Tidligere undersøgelser viste, at hybridisering mellem C. moschata og C. pepo er mulig, men vanskelig 8,15. De interspecifikke krydsninger kan resultere i intet frugtsæt (abort), parthenocarpic frugter uden levedygtige frø (tomme frø), frøfrie frugter, hvor de umodne embryoner ikke udvikler sig (stenospermocarpy) eller frugter med få umodne embryoner, der kan reddes til modne planter gennem embryoredning15,16. For eksempel blev der ikke opnået levedygtige frø ved at krydse C. pepo (borddronning, moder) med C. moschata (stor ost, faderlig), men det gensidige kryds gav 57 levedygtige frø fra 134 bestøvninger9. Hayase fik kun levedygtige frø fra C. moschata og C. pepo krydser, når krydsninger blev foretaget kl. 04:00 ved hjælp af pollen opbevaret ved 10 ° C natten over19. Baggett krydsede otte forskellige C. moschata sorter med C. pepo (delicata) og rapporterede, at ud af 103 samlede bestøvninger blev der opnået 83 frugter, der syntes normale, men ingen af dem indeholdt levedygtige frø8. I en krydsning mellem C. pepo (S179) og C. moschata (NK) opnåede Zhang et al. 15 frugter med 2.994 frø, men kun 12 af disse frø var levedygtige, mens de resterende kun viste rudimentær udvikling. Disse undersøgelser tyder på, at selvom interspecifik krydsning mellem C. moschata og C. pepo er yderst gavnlig, er det krævende at opnå frugter med levedygtige frø fra krydsene16.

Embryoredning er blevet foreslået som en passende metode til at overvinde problemer som følge af tidlig abort eller dårligt udviklede embryoner og er en af de tidligste og mest succesrige in vitro-kulturteknikker til regenerering af umodne embryoner16,20. Embryoredning indebærer in vitro-kultur af underudviklede/umodne embryoner efterfulgt af overførsel til et sterilt næringsmedium for at lette genopretningen af kimplanter og i sidste ende modne planter21. Selvom embryoredning er almindeligt anvendt i squashavl, mangler der en detaljeret beskrivelse af den passende metode, der gør det muligt at anvende den rutinemæssigt. Brug af embryo redningsteknik til at overvinde interspecifikke hybridiseringsbarrierer i Cucurbita arter blev rapporteret allerede i 195422. Imidlertid var succesen med embryoredning i de tidlige undersøgelser enten urapporteret eller meget lav. Metwally et al. rapporterede en succesrate på 10% (regenerering til modne planter) blandt 100 interspecifikke hybridembryoner reddet fra en krydsning mellem C. pepo og C. martinezii23. Sisko et al. rapporterede en variabel succesrate for embryoregenerering blandt embryoner opnået fra forskellige krydskombinationer: regenereringshastigheden for hybrider opnået ved krydsning af C. maxima (Bos. Max) og C. pepo (Gold Rush) var 15,5%, for C. pepo (Zucchini) og C. moschata (Hokaido) var 20%, mens det for C. pepo (Gold Rush) og C. moschata (Dolga) var 37,5%24. Ud over genotype er medier og in vitro-kulturforhold vigtige faktorer for teknikkens succes25,26. I den nuværende undersøgelse blev forskellige krydskombinationer mellem C. moschata og C. pepo testet, og en simpel metode til udnyttelse af embryoredningsteknikken i squash blev udviklet. Udviklingen af en enkel og let reproducerbar embryo redningsteknik vil lette interspecifik hybridisering og germplasmforbedring i squashavlsprogrammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plantning og bestøvning

BEMÆRK: Det er vigtigt at identificere kompatible genotyper, hvis hybridisering ville resultere i frugtsæt og produktion af levedygtige embryoner.

  1. Plantningsforhold og vedligeholdelse
    1. Opnå frø af squashgenotyper (sorter / tiltrædelser) til hybridisering (tabel 1).
    2. Fyld 50 cellestartflader (25 cm bredde x 50 cm længde) med pottemedium ændret med komplet NPK-gødning indeholdende 1,38 g/kg N, 1,38 g/kg P og 1,38 g/kg K.
    3. Så frø til en dybde svarende til deres længde og dække med pottemedium. Vand lejlighederne uden at skabe stående vand. Hold derefter mediet fugtigt ved at vande det i hånden en gang om dagen.
    4. På det andet ægte bladstadium transplanteres frøplanterne i potter med en diameter på 25 cm til 30 cm ændret med en komplet NPK-gødning ved 3 spsk / gryde. Gød planterne en gang om ugen med 500 ml / gryde flydende gødning indeholdende NPK 20:20:20 tilsat til en koncentration på 1 g pr. Gallon vand.
    5. Vedligehold planter i drivhuset ved temperaturer mellem 22-28 ° C under naturligt lysregime. For vining genotyper, giv en understøttende espalier i drivhuset (figur 1).
  2. Udførelse af bestøvninger
    1. Typisk starter blomstringen i squash 6 til 8 uger fra såning afhængigt af sorten (figur 2A, B). Begynd at lave kontrolleret hybridisering (kryds), så snart planterne begynder at blomstre. Under drivhusforhold kan bestøvning udføres året rundt.
    2. Identificer mandlige og kvindelige blomster af C. pepo og C. moschata sorter, der vil være klar til bestøvning den følgende dag. For at identificere sådanne blomster skal du kontrollere for blomster, hvis kronblade har en gul nuance, men ikke er åbne. Tape forsigtigt blomsterne lukket øverst ved hjælp af maskeringstape for at forhindre utilsigtet insektbestøvning (figur 2C, D).
    3. Morgenen den følgende dag er blomsterne klar til at bestøve. Udfør bestøvning inden kl. 10.00 for at forbedre hastigheden af hybridiseringssucces27.
    4. Åbn de kvindelige og mandlige blomster ved forsigtigt at fjerne den tapede øverste del af kronbladene. Fjern kronbladene fra den mandlige blomst og overfør pollen ved forsigtigt at gnide støvanden på stigmatiseringen af den kvindelige blomst (figur 3A).
    5. Efter bestøvning skal du straks lukke den pollinerede kvindelige blomst med maskeringstape. Brug et mærke til at registrere datoen for bestøvning og til at angive de fædre- og moderforældre, der blev brugt i korset (figur 3B).
    6. Et vellykket kryds er indikeret af en udvidet æggestok, som hurtigt danner en lille frugt inden for 1 uge (figur 4A). Planten er derefter klar til høst 45-55 dage efter bestøvning28 (figur 4B).

2. Embryo redningsteknik

  1. Medieforberedelse
    1. Forbered antibiotikalagre: For cefotaxim (natriumsalt) opløses antibiotika i 4 ml deioniseret eller destilleret vand, filtreres gennem et sterilt 0,22 μm sprøjtefilter og laves 0,5 ml aliquots. Opbevares ved -20 °C. Den resulterende stamopløsning vil have en koncentration på 250 mg/ml.
    2. For ampicillin (natriumsalt) opløses pulveret i 10 ml vand, filtreres gennem et sterilt sprøjtefilter på 0,22 μm og aliquot i 1 ml lager med en slutkoncentration på 100 mg/ml. Opbevares ved -20 °C.
    3. Lav Murashige og Skoog (MS) medium ved at opløse 2,45 g medium (4,91 g / L koncentration) i 500 ml destilleret vand i en 1 L flaske. Tilsæt 1,5 g gellangummi og autoklave ved 121 °C i 20 min. Gellangummiet opløses fuldstændigt under autoklavering.
    4. Efter autoklavering afkøles mediet ved at placere flasken i et vandbad ved 50 °C. Fjern antibiotikalagrene fra fryseren og tø dem op i det laminære flowskab.
    5. Overfør mediumflasken til den laminære strømningshætte. Der tilsættes 0,6 ml cefotaximstamopløsning (250 mg/ml) og 0,25 ml ampicillinstam (100 mg/ml) til mellemflasken og blandes godt. Hæld ca. 7 ml af mediet i en steril petriskål (60 mm x 15 mm).
    6. Lad mediet størkne i petriskålene i ca. 15-20 min. Luk petriskålene med tætningspapir og læg dem i en opbevaringsboks. Opbevares ved stuetemperatur.
  2. Embryo redning
    1. Før du starter, skal du rengøre og sterilisere laminar-luftstrømsskabet med 70% ethylalkohol.
    2. Høst squashfrugten ved at bryde/skære den af hovedvinstokken, og desinficer frugtoverfladen ved at vaske med flydende vaskemiddel (f.eks. 0,3% chloroxylenol) i laboratorievasken, indtil alt løst snavs er fjernet (figur 5A).
    3. Skyl med rigeligt ledningsvand. Tør frugten med rene papirhåndklæder. Flyt frugten til laminar-luftstrømsskabet (figur 5B).
    4. Overfladesteriliser frugten ved at sprøjte 70% ethanol på frugten i det sterile laminar-luftstrømsskab. Skær frugten med en steril kniv (figur 5C) og ekstraher frøene.
    5. Brug steril tang til aseptisk at åbne frøbeklædningen og udsætte de umodne embryoner (figur 6). De umodne embryoner anbringes forsigtigt i en petriskål indeholdende MS-medium suppleret med cefotaxim og ampicillin (figur 7A). Luk petriskålen og forsegl med indpakningsfilm.
      BEMÆRK: Afhængigt af embryonets størrelse er det muligt at passe fem eller seks embryoner i en petriskål.
    6. De forseglede petriskåle med embryoner anbringes i et vækstkammer under 16 timer ved 25 °C og en relativ luftfugtighed på 70 %. Hvis der opstår forurening, skal du straks subkulturere de uforurenede embryoner til en ny plade med samme medium.
    7. Cotyledonerne begynder at udvide sig efter 4 dage og bliver grønne om 10 dage (figur 7B). På dette tidspunkt skal du om nødvendigt udføre subkulturering i nye plader, der indeholder det samme medium for at tillade vævsudvidelse. Rødderne begynder at dukke op efter 14 dage (figur 7C), og efter 21 dage vil planterne have udvidede rødder og cotyledoner (figur 7D).
      BEMÆRK: Kulturmediet, der anvendes i protokollen, er egnet til differentiering i skud og rødder uden supplerende vækstregulatorer.
    8. På dette stadium skal du fjerne planterne fra petriskålene og forsigtigt vaske medierne fra rødderne med ledningsvand (figur 8). Placer plantlets i en plastikbeholder (14 cm x 9 cm x 4 cm) og dæk rødderne med våde papirhåndklæder (figur 9A). Dæk beholderen til, og fugt papirhåndklæderne efter behov.
    9. Opbevar beholderne ved stuetemperatur (25-28 °C) og med en fotoperiode på 16 timer. Dette trin vil akklimatisere plantletterne. Efter akklimatisering i 7-10 dage i beholderen vil frøplanterne være ca. 3-4 lange. I løbet af denne periode skal du genfugte papirhåndklæderne efter behov.
    10. Overfør frøplanterne til 50 cellestartflader (25 cm bredde x 50 cm længde) ændret med gødning som tidligere beskrevet og flyt dem til drivhuset (figur 9B). Overvands ikke frøplanter for at undgå råtning; tilføj ca. 10-20 ml pr. celle efter behov.
    11. På det andet til tredje ægte bladstadium transplanteres frøplanterne i potter med en diameter på 30 cm fyldt med pottemedium ændret med gødning som tidligere beskrevet (figur 10A). Giv espalierstøtte til vining planter og udfør kontrolleret hybridisering, når planterne begynder at blomstre, som tidligere beskrevet (figur 10B).
    12. Vedligehold planterne i drivhuset ved temperaturer mellem 22-28 °C under naturligt lysregime. Evaluer planterne for frugt og frøegenskaber.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Frugtsæt og frølevedygtighed
En indledende test blev udført for at bestemme frugtsæt og frølevedygtighed i en række krydskombinationer. I alt 15 squashgenotyper, fire C. pepo og 11 C. moschata, blev valgt (tabel 1). Ud af de 24 interspecifikke krydskombinationer, der blev forsøgt, blev der opnået et frugtsæt til 22 (tabel 2), hvilket repræsenterer en samlet succes på >92% i frugtsættet. Der blev ikke opnået modne frugter ved krydsning af O og M og E og J, mens det højeste antal frugter (n = 6) blev opnået ved krydsning F og J (tabel 2). Antallet af blomster, der blev bestøvet til forskellige krydskombinationer, varierede fra en til 11, og succesraten for bestøvning varierede fra 0% til 100%. Antallet af blomster, der blev bestøvet i forskellige krydskombinationer, varierede afhængigt af antallet af blomstersæt og synkronisering af blomstringen blandt mandlige og kvindelige blomster. Selvom frugter blev opnået fra alle kryds undtagen to, viste evaluering af frugter efter at have skåret dem, at de fleste af frugterne havde aborteret embryoner uden levedygtige frø. Frugter fra de fleste kors så normale ud, men var blottet for frø eller bestod af frø med rudimentære embryoner. I alt 44 frugter blev produceret fra alle krydskombinationerne, og kun en frugt, udviklet ved at krydse C og J, havde dårligt udviklede embryoner, der kunne genvindes gennem embryoredningsteknikken.

Embryo redning og yderligere fremskridt
F1 interspecifik hybrid udviklet ved at krydse C og J havde 44 frø i alt, men kun 10 af dem havde embryoner, der kunne reddes til generationsfremskridt. De resterende frø havde ingen embryoner. Alle 10 embryoner blev dyrket i embryoredningsmedierne og kontrolleret dagligt for deres vækst og udvikling. Størrelsen af de 10 umodne embryoner varierede fra 3, 51 mm til 8, 26 mm. Succesraten for embryoredning var 80%. F 1 interspecifikke hybrider (brolinjer) udviklet ved at krydse C. moschata og C. pepo (C og J) indeholdt genomerne af begge arter i et forhold på 1:1 (50% hver). Disse planter blev brugt som brolinjer til introduktion af økonomisk vigtige træk på tværs af de to arter. For eksempel ville krydsning af disse brolinjer med C. moschata resultere i hybrider med henholdsvis 75% C. moschata og 25% C. pepo genetisk baggrund. Frugterne opnået fra disse brolinjer havde en blanding af uigennemtrængelige frø og frø med umodne embryoner, der efterfølgende krævede vævskultur til regenerering. For eksempel havde en af frugterne i alt 54 frø, hvoraf 14 frø havde umodne embryoner, der blev reddet ved hjælp af protokollen beskrevet her.

Figure 1
Figur 1: Understøttende espalier til lodret voksende squashplanter i drivhuset. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Illustration af åbne og tapede blomster. Åben (A) mandlig og (B) kvindelig squashblomst i drivhuset. (C) En tapet hanblomst fra Cucurbita moschata faderlig forælder. (D) En tapet kvindelig blomst fra Cucurbita pepo moderforælder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Illustration af bestøvning . (A) Overfør pollen fra hanblomsten ved forsigtigt at gnide støvfanget på hunblomstens stigma. (B) Efter bestøvning tapes hunblomsten, og der anvendes et mærke til registrering af bestøvningsdatoen og de fædrene og moderens forældre, der anvendes i korset. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Frugt sæt . (A) Efter bestøvning vil æggestokken udvide sig hurtigt og danne en lille frugt inden for 1 uge. (B) Frugten er klar til høst 45 dage efter bestøvning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Tilberedning af frugt . (A) Vask frugten med vaskemiddel. Høst og desinficer frugtens overflade ved at vaske den med flydende vaskemiddel i laboratorievasken. (B) Skyl og tør frugten. Tør frugten med rene papirhåndklæder efter skylning med rigeligt ledningsvand, og flyt den til laminar-luftstrømsskabet. (C) Skær frugten åben med en steril kniv. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Ekstrakt embryo fra frøene. Brug steril tang til aseptisk at åbne frøbeklædningen og udsætte det umodne embryo. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Regenerering af embryoner i medlemsstaternes medier. (A) Anbring forsigtigt umodne embryoner i en petriskål, der indeholder MS-medium. (B) Cotyledonerne udvides og bliver grønne inden for 10 dage. (C) Rødderne begynder at dukke op efter 14 dage. (D) Efter 21 dage vil plantlets have udvidede rødder og cotyledoner, som er klar til at blive overført til en plastbeholder til akklimatisering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Vask rødderne. Fjern planterne fra petriskålene og vask forsigtigt medierne fra rødderne med ledningsvand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Akklimatisere plantletterne . (A) Placer plantlets i en plastikbeholder og dæk rødderne med et vådt papirhåndklæde i 5 dage for at akklimatisere dem. (B) Overfør planterne til cellebakker, der indeholder kommerciel potteblanding ændret med komplet NPK-gødning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Transplanter frøplanterne i potter. (A) På det andet til tredje ægte bladstadium transplanteres frøplanterne i potter med en diameter på 30 cm fyldt med pottemedium ændret med gødning. (B) Giv espalierstøtte til vining planter og lav kontrolleret hybridisering, når planterne begynder at blomstre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Lab-kode Art Kilde
En C. Moschata Lokale landmænd marked
B C. Moschata Lokale landmænd marked
C C. Moschata Lokale landmænd marked
D C. Moschata Lokale landmænd marked
E C. Moschata Lokale landmænd marked
F C. Moschata Lokale landmænd marked
G C. Moschata University of Florida avlslinje
H C. Moschata University of Florida avlslinje
Jeg C. Pepo NCRPIS (nordcentral regional anlæg intruduktionsstation)
J C. Pepo NCRPIS (nordcentral regional anlæg intruduktionsstation)
M C. Pepo NCRPIS (nordcentral regional anlæg intruduktionsstation)
O C. Moschata University of Florida avlslinje
Q C. Moschata University of Florida avlslinje
W C. Pepo University of Florida avlslinje
Y C. Moschata Burpee Frø Co

Tabel 1: I alt 15 genotyper af squash, fire C. pepo og 11 C. moschata, blev brugt i undersøgelsen til interspecifikke kryds.

Kryds (kvinde x mand) N. af bestøvede blomster N. af frugter Frugt sæt (%) N. af afbrudte frø N. af umodne embryoner N. af reddede embryoner
A (C. moschata) x I (C. pepo) 5 4 80 0 0 0
H (C. moschata) x I (C. pepo) 2 2 100 0 0 0
B (C. moschata) x J (C. pepo) 2 1 50 0 0 0
C (C. moschata) x J (C. pepo) 3 1 33.3 44 10 8
E (C. moschata) x J (C. pepo) 6 0 0 0 0 0
F (C. moschata) x J (C. pepo) 11 6 54.5 0 0 0
G (C. moschata) x J (C. pepo) 2 2 100 0 0 0
J (C. pepo) x H (C. moschata) 7 2 28.6 0 0 0
J (C. pepo) x O (C.moschata) 6 1 16.7 0 0 0
O (C. moschata) x J (C. pepo) 6 1 16.7 0 0 0
Q (C. moschata) x J (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
C (C. moschata) x M (C. pepo) 4 3 75 0 0 0
D (C. moschata) x M (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
F (C. moschata) x M (C. pepo) 9 5 55.6 0 0 0
G (C. moschata) x M (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
O (C. moschata) x M (C. pepo) 22 0 0 0 0 0
Q (C. moschata) x M (C. pepo) 2 1 50 0 0 0
F (C. moschata) x B (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
G (C. moschata) x W (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
H (C. moschata) x W (C. pepo) 2 1 50 0 0 0
O (C. moschata) x W (C. pepo) 0 0 0 0 0 0
Y (C. moschata) x W (C. pepo) 3 2 66.7 0 0 0
M (C. pepo) x H (C.moschata) 3 2 66.7 0 0 0
M (C. pepo) x O (C.moschata) 4 4 100 0 0 0
Total 44 10 8

Tabel 2: Krydskombinationer forsøgt med de 15 genotyper af squash og det tilsvarende frugtsæt, antal aborterede frø, umodne embryoner og vellykkede embryoredninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er to hovedflaskehalse for vellykket interspecifik hybridisering mellem C. moschata og C. pepo: krydskompatibilitetsbarriere, som bestemmes af genotyperespons til at producere hybridembryoner og postbefrugtningsbarrierer, som hindrer udviklingen af hybridembryoner til normale frø. Som tidligere rapporteret for squash afslørede krydskompatibilitetstesten i den nuværende undersøgelse, at det meste af frugten udviklede sig parthenokarpisk, med de fleste frø uigennemtrængelige16. Forældrenes genotype har en betydelig indflydelse på kompatibiliteten af interspecifik hybridisering mellem C. moschata og C. pepo. Blandt de 24 krydskombinationer, der blev testet i den aktuelle undersøgelse, gav kun en (C og J) umodne embryoner til embryoredning. Som sådan var undersøgelsen begrænset af manglen på biologiske replikater til test af effektiviteten af den udviklede protokol. Imidlertid blev der opnået en regenereringseffektivitet på 80% for de 10 umodne embryoner, der blev reddet fra C- og J-krydset. Tidligere undersøgelser har rapporteret lavere regenereringssucces fra embryoredninger for C. pepo og C. moschata kryds, hvilket viser effektiviteten af den nye protokol14,15. For eksempel rapporterede De Oliveira et al., at ud af 26 embryoner opnået fra en krydsning mellem C. pepo cv. Asmara og C. moschata cv. Piramoita, ingen regeneranter blev opnået. Forfatterne rapporterede imidlertid en 16% regenereringssucces, når en anden kombination af genotyper (C. pepo cv. Asmara og C. moschata cv. Duda) blev brugt14. I en anden undersøgelse af interspecifik hybridisering mellem forskellige Cucurbita-arter rapporterede Rakha et al. en regenereringseffektivitet på 40% og 15% fra de umodne embryoner opnået ved krydsning af henholdsvis C. ficifolia x C. pepo og C. martinezii x C. pepo.15. Den nuværende undersøgelse anvendte et MS-medium uden supplerende vækstregulatorer sammenlignet med tidligere etablerede protokoller, der anvendte komplekse medier til embryoredning 15,29,30. Desuden var tilsætningen af antibiotika cefotaxim og ampicillin tilstrækkelig til at forhindre mikrobiel kontaminering. Således giver mediet fordele som værende billigere, let at forberede uden behov for højtuddannet personale, og det kan vedtages af mindre avlsprogrammer med begrænsede ressourcer.

I den nuværende undersøgelse blev frugter høstet 45-55 dage efter bestøvning (DPP) for at maksimere embryomodning og regenerering. DPP valgt til den aktuelle undersøgelse var baseret på en tidligere rapport, der viste, at optimal akkumulering af energireserver (for det meste lipider og proteiner) til embryoner forekom ved 60 DPP31,32. I muskmelon rapporterede Nunez-Palenius et al. en positiv sammenhæng mellem succesen med embryoredning og DPP30.

I den nuværende undersøgelse gav anden generation af frugter udviklet ved at krydse interspecifikke F1-hybrider med C. moschata ikke normale frø. Denne observation indikerer, at det er vanskeligt at overvinde fertilitetsbarrieren mellem C. moschata og C. pepo i en enkelt generation som tidligere rapporteret16. Vedtagelsen af den nuværende protokol vil imidlertid hjælpe med en vellykket udvikling af Cucurbita interspecifikke hybrider i avlsprogrammer. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme krydskompatibilitet af et bredere udvalg af genotyper for at udvide germplasm tilgængelighed for opdrættere

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af USDA National Institute of Food and Agriculture, NRS Project No. FLA-TRC-006176 og University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
autoclave Steris AMSCO LAB 250
balance
cefotaxime Sigma Alfrich C 7039
centrifuge tubes (1.5 ml) Sigma Alfrich T9661
detergent
ethanol, 95% Decon Labs 2805HC
forceps VWR 82027-408
gellan gum Caisson Laboratories G024
growth chamber or illuminated shelf
laminar hood / biosafety cabinet The Baker Company, Inc Edgegard
masking tape Uline S-11735
media bottle
Murashige & Skoog Medium Research Products International M10200
NPK fertilizer (20-20-20) BWI Companies, Inc  PR200
Osmocote Plus fertilizer BWI Companie,s Inc OS90590
Parafilm M Sigma Alfrich P7793
Petri dish (60 x 15 mm) USA Scientific, Inc 8609-0160
plant pots BWI Companies, Inc NP4000BXL
plastic food containers, reused Oscar Mayer 4470003330
plastic hang tags Amazon B07QTZRY6T
potting mix Jolly Gardener Pro-Line C/B
seedling starter trays BWI Companies Inc GPPF128S4
syringe filter (0.22 um ) ExtraGene B25CA022-S
trellis support The Home Depot  2A060006
water bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paris, H. S. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. 20, (2016).
  2. Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).
  3. Paris, H. S., et al. Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers. Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).
  4. Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. Cucurbits. , CAB International. Wallingford, Oxon, UK. (1997).
  5. Teppner, H. Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics. Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).
  6. Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters. International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).
  7. Paris, H. S. History of the cultivar-groups of Cucurbita pepo. Horticultural Reviews-Westport Then New York. 25, 71 (2001).
  8. Baggett, J. R. Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. 'Butternut and C. pepo L. 'Delicata'. The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).
  9. Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).
  10. Whitaker, T. W., Bohn, G. W. The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita. Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).
  11. Bemis, W. P., Nelson, J. M. Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development. Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).
  12. Washek, R. L., Munger, H. M. Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species. The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).
  13. Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids. International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).
  14. De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross. Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).
  15. Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique. World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).
  16. Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata. HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).
  17. Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata. Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).
  18. Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo). Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).
  19. Hayase, H. Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids. Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).
  20. Reed, S. Embryo rescue. Plant development and biotechnology. , 235-239 (2004).
  21. Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K. Embryo rescue in plants-a review. Euphytica. 89 (3), 325-337 (1996).
  22. Wall, J. R. Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture. Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).
  23. Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture. Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).
  24. Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique. Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).
  25. Giancaspro, A., et al. Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy. Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).
  26. Warchol, M., et al. The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses. Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).
  27. Nepi, M., Pacini, E. Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo. Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).
  28. Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).
  29. Moon, P., Meru, G. Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium. Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).
  30. Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. Plant Embryo Culture. , Humana Press. 107-115 (2011).
  31. Vining, K. J., Loy, J. B. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. McCreight, J. M. , ASHS Press. Alexandria, VA. 64-69 (1998).
  32. Vining, K. J. Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , University of New Hampshire. L.), Durham, NH. M.S. Thesis (1999).

Tags

Biologi udgave 187
Embryo Rescue Protocol til interspecifik hybridisering i squash
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fu, Y., Shrestha, S., Moon, P.,… More

Fu, Y., Shrestha, S., Moon, P., Meru, G. Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash. J. Vis. Exp. (187), e64071, doi:10.3791/64071 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter