Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/64098
Automatic Translation
1,5, 1,5, 1, 1, 2, 3,5, 4, 5,6,7, 1, 1,5,8,9
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

Summary

Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.

Abstract

Een fundamentele vraag in de mechanobiologie is hoe levende cellen extracellulaire mechanische stimuli waarnemen in de context van celfysiologie en pathologie. De cellulaire mechano-sensatie van extracellulaire mechanische stimuli wordt verondersteld zich te bevinden via de membraanreceptoren, het bijbehorende eiwitcomplex en het cytoskelet. Recente ontwikkelingen in de mechanobiologie tonen aan dat de celkern in het cytoplasma zelf onafhankelijk mechanische stimuli tegelijkertijd kan waarnemen. Een mechanistisch begrip van hoe de celkern mechanische stimuli detecteert, transduceert en erop reageert, ontbreekt echter, voornamelijk vanwege de technische uitdagingen bij het openen en kwantificeren van de kernmechanica met conventionele hulpmiddelen. Dit artikel beschrijft het ontwerp, de fabricage en de implementatie van een nieuwe magnetische krachtactuator die nauwkeurige en niet-invasieve 3D-mechanische stimuli toepast om de celkern direct te vervormen. Met behulp van CRISPR/Cas9-engineered cellen toont deze studie aan dat deze tool, in combinatie met hoge resolutie confocale fluorescerende beeldvorming, de onthulling mogelijk maakt van de real-time dynamiek van een mechano-gevoelig yes-associated protein (YAP) in enkele cellen als functie van kernvervorming. Deze eenvoudige methode heeft het potentieel om de huidige technologische kloof in de mechanobiologiegemeenschap te overbruggen en antwoorden te bieden op de kenniskloof die bestaat in de relatie tussen nucleusmechanotransductie en celfunctie.

Introduction

Deze studie heeft tot doel een nieuwe techniek te ontwikkelen en toe te passen om kernmechanobiologie op te helderen door de magnetische actuatoren die mechanische kracht rechtstreeks op de celkern uitoefenen te combineren met de confocale fluorescentiemicroscopie die tegelijkertijd de structurele en functionele subcellulaire veranderingen in beeld brengt. Cellen detecteren extracellulaire biofysische signalen, waaronder weefselstijfheid 1,2,3,4, interstitiële vloeistofdruk en schuifspanning 5,6,7, oppervlaktetopologie/geometrie 8,9,10,11,12 en spanning/compressiespanning 13,14, 15,16. Biofysische signalen worden omgezet in biochemische signalen en veroorzaken potentiële stroomafwaartse veranderingen van genexpressie en celgedrag - een proces dat bekend staat als mechanotransductie 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Om mechanotransductieprocessen te bestuderen, zijn talloze technieken ontwikkeld om mechanische kracht op de cellen uit te oefenen, zoals atoomkrachtmicroscopie28, celrekapparaat29, bio-MEMS (micro-elektromechanische systemen) krachtsensor 15,30,31, afschuifreologie 32 en Stereo Vision System33 . Een recente review vat de benaderingen samen om extracellulaire mechanische signalen toe te passen en te interfereren met mechanosensing34. Tot op heden oefenen de meeste van deze methoden kracht uit op het celplasmamembraan en cellen ontvangen deze extracellulaire biofysische signalen rechtstreeks via membraanreceptoren zoals integrine, cadherine, ionkanalen en G-eiwit-gekoppelde receptoren. Vervolgens geven ze het signaal door aan het intracellulaire cytoskelet en de kern. Bijvoorbeeld, met behulp van yes-associated protein (YAP) translocatie als een indicator van mechano-sensing, wordt aangetoond dat cellen de mechanische signalen van substraatstijfheid en extracellulaire spanning van het celmembraan detecteren en deze via het cytoskelet naar de kern overbrengen om YAP-cytoplasma-naar-kerntranslocatie te induceren28,35.

Recent bewijs suggereert dat de celkern zelf een onafhankelijke mechano-sensoris 8,36,37. Dit wordt bewezen door experimenten uitgevoerd op de geïsoleerde kern geoogst uit cellen, waar werd onthuld dat kernen adaptief hun stijfheid veranderen als reactie op de mechanische kracht die direct op hen wordt uitgeoefend36. Tijdens veel fysiologische omstandigheden voelen kernen in zowel tumor- als gezonde cellen extracellulaire biofysische signalen en veranderen hun mechanische eigenschappen en assemblages 38,39,40. Bijvoorbeeld, bij extravasatie neemt de nucleaire stijfheid van tumorcellen af en handhaaft de zachtheid gedurende meer dan 24 h38. Tijdens de migratie door de besloten interstitiële ruimte verliezen en herstellen de kernen van tumorcellen vaak hun structurele integriteit39. De manier waarop de kern het biofysische signaal waarneemt, is echter onbekend, hoewel verschillende nucleaire enveloppe-eiwitten en families van eiwitten betrokken zijn gebleken, zoals Lamin A / C en linker van nucleoskelet en cytoskelet (LINC) complex38,41. Vandaar dat nieuwe niet-invasieve methoden die direct kracht kunnen uitoefenen op de kern het effect van krachtoverdracht van het cel-plasmamembraan en cytoskelet zullen loskoppelen en zullen helpen de voorheen ontoegankelijke moleculaire mechanismen van nucleaire mechano-detectie op te helderen.

Onderzoek waarbij optische pincetten werden gebruikt om organellen42 te manipuleren en microbeads geïnjecteerd in cellen43 toonde het technologische vermogen aan om direct kracht uit te oefenen op de kern. De optische pincettechniek heeft echter verschillende beperkingen: (1) optische pincetten met lage doorvoer manipuleren vaak maar één cel of microbead tegelijk; en (2) potentiële fotoschade en temperatuurartefact-vervorming van kernenergie vereist tientallen pN36, en het overeenkomstige benodigde laservermogen is ongeveer 10 mW per pN 44,45. Een dergelijke laserintensiteit is voldoende om fotoschade in de cellen te veroorzaken en de functies van de perturbcel tijdens het experimentte verstoren 46.

Magnetische kracht toegepast door microbeads in levende cellen toont het potentieel om direct kracht uit te oefenen op de kern en overwint de beperkingen van optische pincetten. Zodra microbeads in het cytoplasma worden afgeleverd, kan een magnetisch veld een magnetische kracht uitoefenen op meerdere microbeads tegelijkertijd op een manier met hoge doorvoer. Het magnetisch veld beïnvloedt de celfuncties niet47, maar genereert kracht van pN naar nN, wat voldoende is om nucleaire vervorming te induceren 36,48,49. Tot op heden is manipulatie van magnetische microbeads toegepast op celplasmamembraan48, in het cytoplasma50, op F-actine51, in de kern47 en op de geïsoleerde kern36. Magnetische manipulatie van microbeads is echter nooit gebruikt om directe mechanische kracht op de nucleaire envelop toe te passen om mechanotransductie in de kern te bestuderen.

In dit artikel wordt een eenvoudige techniek ontwikkeld om niet-invasief magnetische microbeads in het cytoplasma af te leveren en deze microbeads te gebruiken om mechanische kracht op de kern uit te oefenen (figuur 1). Hier worden CRISPR / Cas9-engineered menselijke normale B2B-cellijnen gebruikt die endogeen mNeonGreen21-10 / 11-gelabelde YAP uitdrukken om de methode te valideren. YAP is een mechano-gevoelig eiwit en de translocatie van YAP wordt gereguleerd door nucleaire mechano-sensing14,28. De CRISPR/Cas9-gereguleerde knock-in benadering werd gekozen om endogene YAP te taggen met een fluorescerend eiwit (FP) mNeonGreen21-10/11. Hoewel bekend is dat CRISPR-bewerking onvolledige efficiëntie en off-target effect heeft, integreerden de protocollen in eerdere publicaties fluorescentiesortering om te selecteren op correcte open leesframe-invoeging 52,53,54. Met deze extra selectielaag werd geen off-target tagginggebeurtenis waargenomen in meer dan 20 cellijnen die eerder52,53,54,55 genereerden. Dit is een gesplitst fluorescerend eiwitconstruct, maar in principe zou elke expresseerbare fluorescerende tag bruikbaar kunnen zijn. Deze etiketteringsbenadering is superieur aan transgene- of antilichaammethoden. Ten eerste, in tegenstelling tot de transgene expressie, handhaaft het getagde eiwit single-copy gendosering en expressie in de fysiologische context van het inheemse gen regulerende netwerk, waardoor afwijkingen in eiwitconcentratie, lokalisatie en interactie worden beperkt. De taggingmethode die in deze studie wordt gebruikt, bereikt een orde van grootte hogere doorvoer en efficiëntie dan volledige FP-tagging. Het vermijdt ook uitdagingen in verband met immunofluorescentie als gevolg van fixatieartefacten en de beperkte beschikbaarheid van hoogwaardige antilichamen met hoge specificiteit. Ten tweede zorgt de benadering die in dit artikel wordt gebruikt voor minimale verstoring van de celfysiologie en maakt de real-time openbaring van alle endogene YAP's op authentieke wijze mogelijk. Andere gangbare transgene methoden leiden daarentegen vaak tot overexpressie van YAP. De resulterende kunstmatige distributie kan mogelijk cytotoxiciteit veroorzaken en de mechano-detectie van cellen beïnvloeden 56,57,58.

Deze studie presenteert een protocol om direct kracht uit te oefenen op de kern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren. Samenvattend laten de hier gepresenteerde protocollen zien hoe (1) magnetische microbeads in de cel kunnen worden afgeleverd terwijl ze zich buiten de kern bevinden, (2) de microbeads manipuleren om magnetische kracht op de kern uit te oefenen, (3) confocale fluorescerende beeldvorming van de cellen uitvoeren tijdens manipulatie, en (4) kwantitatief de YAP-verhouding tussen nucleair en cytoplasma (N / C) analyseren tijdens het krachttoepassingsproces. De resultaten suggereren dat (1) door endocytose magnetische microbeads niet-invasief kunnen worden afgeleverd in het cytoplasma van B2B-cellen binnen 7 uur (figuur 2 en figuur 3); en (2) gekwantificeerde magnetische kracht die rechtstreeks op de kern wordt uitgeoefend (figuur 4, figuur 5 en figuur 6) alleen kan leiden tot diverse veranderingen in de YAP N/C-verhouding in CRISPR/Cas9-gemanipuleerde B2B-cellen (figuur 7 en figuur 8).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Onderhoud van CRISPR/Cas9-engineered B2B cellen

  1. Kweek B2B-cellen in een T25-kolf met RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine.
  2. Bewaar de B2B-cellen in een bevochtigde incubator op 37 °C met 5% CO2.
  3. Subcultuur de B2B-cellen wanneer de samenvloeiing 70% tot 80% bereikt.
  4. Bewaar de B2B cellijn in RPMI-1640 kweekmedium met 10% (v/v) DMSO in een -80 °C vriezer.
  5. Gebruik de B2B-cellen met een passagegetal van minder dan 10 in de experimenten.

2. Celkweek

  1. Zaai de cellen op een petrischaaltje met glazen bodem.
    1. Verplaats de kolf met B2B-cellen naar binnen van de incubator naar de bioveiligheidskast.
    2. Verwijder het kweekmedium in de kolf met behulp van een aanzuigende pipet met een aangesloten vacuümpomp.
    3. Was de kolf met 2 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    4. Verwijder PBS met de aanzuigende pipet.
    5. Voeg 0,5 ml 0,05% Trypsine-oplossing toe om cellen los te maken van de bodem van het kolfsubstraat.
    6. Zet de kolf 5 min in de couveuse.
    7. Verplaats de kolf naar de bioveiligheidskast. Voeg 5 ml nieuw kweekmedium toe aan de kolf en pipetteer de oplossing op en neer.
    8. Deponeer 50 μL van het medium met cellen (300 cellen/μL) op de petrischaal met glazen bodem. Voeg 2 ml kweekmedium toe aan de petrischaal.
    9. Plaats de petrischaal in de couveuse. Wacht 12 uur totdat de cellen zich hechten.
  2. Kweek de cellen met magnetische microbeads.
    1. Weeg 0,2 g van 7 μm gemiddelde diameter carbonyl ijzer microbeads (hierna 7 μm microbeads genoemd, zie de tabel met materialen).
    2. Gebruik een pipet om de microbeads op te hangen in 1 ml RPMI-1640 kweekmedium.
    3. Neem de petrischaal met B2B-cellen mee naar de bioveiligheidskast.
    4. Voeg 200 μL van het medium met microbeads toe aan de petrischaal.
      OPMERKING: Voeg het medium snel toe om neerslag van de microbeads te voorkomen.
    5. Plaats de petrischaal terug in de incubator totdat microbeads door de cellen zijn geïnternaliseerd. Controleer de internalisatie elke 6 uur om de optimale tijd voor internalisatie voor verschillende cellijnen te bepalen.
    6. Om de internalisatie te controleren, voert u confocale fluorescentiebeeldvorming uit om de microbead-, nucleaire en celgrens te visualiseren. Als de microbead door de cel wordt geïnternaliseerd, bevindt deze zich binnen de celgrens.

3. Visualisatie van de kern

  1. Verwarm 1,5 ml van het kweekmedium in de incubator gedurende 15 minuten.
  2. Doe het licht van de bioveiligheidskast uit. Neem de petrischaal met de cel, het verwarmde kweekmedium, de kernvlek en de Verapamil HCl in de bioveiligheidskast.
    OPMERKING: Nucleaire kleuringscomponenten zijn gevoelig voor licht. Vermijd blootstelling aan licht tijdens het gebruik.
  3. Verdun 1000x kernvlek door DMSO tot 100x.
  4. Verdun 100 mM Verapamil HCl door DMSO tot 10 mM.
  5. Voeg 15 μL 100x kernvlek en 15 μL 10 mM Verapamil HCl toe aan 1,5 ml kweekmedium. Meng goed door op en neer te pipetteren.
  6. Haal het kweekmedium uit de petrischaal. Voeg het kweekmedium met nucleaire kleuring toe aan de petrischaal.
  7. Zet de cellen terug in de incubator gedurende meer dan 2 uur.

4. Voorbereiding van de hardware voor magnetische krachttoepassing

  1. 3D-print alle onderdelen met acrylonitrilbutadieen styreen (ABS) en monteer ze volgens het CAD-ontwerp (figuur 1A). Het CAD-ontwerp is opgenomen in de materiaaltabel.
  2. Gebruik dubbelzijdige tape om de magneet aan het magneetbewegende apparaat te bevestigen (figuur 1A).
  3. Plaats het magneetbewegende apparaat naast de microscoopfase. Gebruik de drie knoppen om de ruimtelijke locatie van de magneet aan te passen totdat deze tussen 13 mm en 120 mm boven de petrischaal kan bewegen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de bovengrens van de afstand tussen de magneet en de petrischaal zo groot mogelijk is om ongewenste krachttoediening op de magnetische microbeads te voorkomen. 120 mm is de maximale waarde in deze experimentele opstelling. Zorg ervoor dat de magneet niet interfereert met microscooponderdelen, inclusief doelstellingen en gemotoriseerde stadia.
  4. Zet de magneet op de hoogste z-stand (op 120 mm).

5. Force applicatie en live-cell imaging

  1. Opstelling van de omgevingskamer voor beeldvorming op lange termijn
    1. Breng 75% ethanoloplossing aan om de omgevingskamer grondig te steriliseren en te reinigen.
    2. Plaats de omgevingskamer op het gemotoriseerde stadium van de omgekeerde microscoop.
    3. Open de CO2-tank en stel het CO 2-indebiet in op 160 ml/ min.
    4. Stel de temperatuur van de kamer in op 44 °C (boven), 42 °C (bad) en 40 °C (stadium).
    5. Voeg 20 ml gezuiverd water toe aan het bad van de omgevingskamer om 90% luchtvochtigheid te behouden.
    6. Verwijder de petrischaal met glazen bodem die doelcellen bevat uit de weefselkweekincubator en plaats deze in de kamer.
    7. Breng de metalen klem van de omgevingskamer aan om de positie van de petrischaal te bevestigen.
      OPMERKING: De petrischaal moet stevig in de kamer worden geklemd, omdat de magnetische kracht de schotel kan verplaatsen als deze niet wordt vastgeklemd.
    8. Sluit het deksel van de kamer.
  2. Optimalisatie van beeldvormingsparameters
    1. Optimaliseer de grootte van het gaatje: het gaatje blokkeert de onscherpe fotonen. Een groter gaatje levert meer onscherpe fotonen op, maar een helderder beeld. Een kleiner gaatje zorgt voor een scherper en zwakker beeld. Zorg ervoor dat u de grootte van het gaatje optimaliseert om in-focus confocale beelden te krijgen met de juiste signaal-ruisverhouding.
    2. Optimaliseer de laserintensiteit: De laserintensiteit bepaalt de intensiteit van excitatie en dus emissielicht. De lage laserintensiteit geeft een lage signaal-ruisverhouding. Een te hoge laserintensiteit veroorzaakt fotobleaching. Pas de laserintensiteit dienovereenkomstig aan.
    3. Optimaliseer de stapgrootte en stappen: Stappen en stapgrootte bepalen hoeveel afbeeldingen in een Z-stack worden gebruikt. Kleinere stapgroottes en meer stappen zullen de Z-stack resolutie verhogen, maar zullen ook de fotobleaching verhogen. In dit experiment werd een stapgrootte van 1 μm gebruikt voor de cellen met een celhoogte van ~15 μm.
    4. Optimaliseer de belichtingstijd: De belichtingstijd bepaalt hoe lang de cel wordt blootgesteld aan de excitatielaser. Een lage belichtingstijd zal de signaal-ruisverhouding verlagen. Een hoge belichtingstijd zal fotobleaching veroorzaken. In dit experiment werd een belichtingstijd van 1 frame per 4 s gebruikt.
    5. Optimalisatie van beeldparameters: wijzig een van de vier parameters iteratief en houd de andere parameters consistent. Meet elke keer de YAP N/C-verhouding van elke afbeelding en vergelijk de YAP N/C-ratioverandering om het fotobleachingsniveau te bepalen. Herhaal het optimalisatieproces totdat een balans is bereikt tussen de signaal-ruisverhouding, beeldsnelheid en fotobleaching.
    6. Definieer de beeldbewerkingsconfiguraties met behulp van de geoptimaliseerde beeldparameters voor snellere beeldinstellingen tijdens de experimenten.
      OPMERKING: Configuraties die in dit onderzoek worden gebruikt, worden beschreven in rubriek 5.3 van de beeldvormingsparameters. Om de beeldparameters van configuraties in paragraaf 5.3 te optimaliseren, gebruikt u dezelfde methode als in stap 5.2.5.
  3. Toepassing met kleine krachten en confocale beeldvorming
    OPMERKING: Nikon Ti2-E microscoop werd gebruikt voor beeldvorming in deze studie, en gedetailleerde stappen voor beeldacquisitie worden hieronder gegeven.
    1. Open de omgekeerde microscoop. Open de softwaretoepassing Elements.
    2. Definieer configuratie magnetic_find. Controleer alleen het FITC-kanaal. Stel PMT HV in = 70, Offset = 0, Laserintensiteit = 10. Stel de scansnelheid in op 1 frame per 2 s door op de knop 1/2 te klikken. Stel de grootte van het gaatje in op 1,2 AU door op de knop 1.2 A.U. te klikken. Deze configuratie wordt gebruikt in stap 5.3.5.
    3. Definieer configuratie magnetic_YAP_Nucleus. Controleer het FITC-kanaal. Stel PMT HV in = 70, Offset = 0, Laserintensiteit = 10. Stel de scansnelheid in op 1 frame per 4 s door op de knop 1/2 te klikken. Stel de grootte van het gaatje in op 1,2 AU door op de knop 1.2 A.U. te klikken. Om de kerngrens en de intensiteit van de kernvlek in beeld te brengen, controleert u het Cy5-kanaal. Stel PMT HV in = 70, Offset = 0, Laserintensiteit = 10. De grootte van het gaatje is geoptimaliseerd voor 3D YAP-beeldvorming. Klik niet opnieuw op de 1.2 A.U.- knop nadat u het Cy5-kanaal hebt gecontroleerd. Deze configuratie wordt gebruikt in stap 5.3.7.
    4. Schakel INDIEN NODIG DIA in via Elements . Open SpinView, gebruik een helder veld en pas de focus van het object aan om een duidelijk scherpstellend beeld van cellen te krijgen. Gebruik een 10x-objectief om geschikte meerdere afzonderlijke cellen te vinden in drie omstandigheden: met een enkele microbead erin, met meerdere microbeads erin en zonder microbead erin. Schakel over naar 40x-doelstelling. Geef deze positie een naam met het juiste positienummer.
    5. Open elementen. Klik op magnetic_find. Klik op de knop Interlock verwijderen .
    6. Klik op Scannen en pas de Z-positie van het brandpuntsvlak aan. Klik op de knoppen Boven en Onder om de onder- en bovengrens in te stellen voor de Z-stack van de geselecteerde cellen. Stop het scannen door nogmaals op Scannen te klikken.
    7. Schakel over naar magnetic_YAP_Nucleus configuratie. Stel bestandsnaam in als before_small_force.nd2. Klik op de knop Uitvoeren met de opgenomen Z-stack.
    8. Schakel over naar het juiste lichtpad en schakel DIA in. Open SpinView en klik op de opnameknop. Draai ondertussen aan de knop van het magneetbewegende apparaat om de magneet tot 46 mm boven de bodem van de petrischaal te verplaatsen. Sla de reeks heldere veldafbeeldingen of video op. Bekijk de video om te bevestigen dat microbeads verplaatsingen vertonen die worden veroorzaakt door magnetische kracht.
    9. Herhaal stap 5.3.5-5.3.7; stel de bestandsnaam in op after_small_force.nd2.
    10. Schakel over naar het juiste lichtpad en schakel DIA in. Open vervolgens SpinView en klik op de opnameknop. Draai ondertussen aan de knop van het magneetbewegende apparaat om de magneet tot 120 mm boven de bodem van de petrischaal te bewegen. Sla de reeks heldere veldafbeeldingen of video op.
    11. Herhaal stap 5.3.5-5.3.7 en stel de bestandsnaam in op before_large_force.nd2.
  4. Toepassing met grote kracht en confocale beeldvorming
    1. Verwijder het deksel van de omgevingskamer zodat de magneet 13 mm boven de bodem van de petrischaal kan komen.
    2. Schakel over naar het juiste lichtpad en schakel DIA in. Open SpinView en klik op de opnameknop. Draai ondertussen aan de knop van het magneetbewegende apparaat om de magneet naar beneden te bewegen tot 13 mm boven de bodem van de petrischaal. Sla de reeks heldere veldafbeeldingen of video op. Bekijk de video om te bevestigen dat microbeads verplaatsingen vertonen die worden veroorzaakt door magnetische kracht.
    3. Herhaal stap 5.3.5-5.3.7 en stel de bestandsnaam in op after_large_force.nd2.
    4. Schakel over naar het juiste lichtpad en schakel DIA in. Open vervolgens SpinView en klik op de opnameknop. Draai ondertussen aan de knop van het magneetbewegende apparaat om de magneet tot 120 mm boven de bodem van de petrischaal te bewegen. Sla de reeks heldere veldafbeeldingen of video op.
    5. Herhaal stap 5.3.5-5.3.7; stel de bestandsnaam in op retract_large_force.nd2.
    6. Sluit de deksel van de omgevingskamer.
  5. Herhaal stap 5.2 en 5.3 voor meerdere gezichtsvelden om indien nodig meer gegevens te verkrijgen.

6. Beeldverwerking en data-analyse

  1. Kwantificering van de YAP N/C-ratio
    1. Open Fiji ImageJ. Open de .nd2-afbeeldingen die in stap 5 zijn gemaakt.
    2. Klik op Analyseren > Metingen instellen. Controleer gebied, geïntegreerde dichtheid, gemiddelde grijswaarde en vormbeschrijvingen.
    3. Gebruik het Cy5-kanaal om de kern te identificeren. Klik op Freehand Selections om de vrije selectietool te gebruiken om de kern te schetsen. Controleer ook de macro van het automatische nucleaire masker in ImageJ (zie de tabel met materialen).
    4. Klik op Analyseren > meten in het FITC-kanaal. De gemeten waarde van het gemiddelde is de gemiddelde nucleaire YAP-intensiteit DN.
    5. Gebruik het Cy5-kanaal om de kern te identificeren. Gebruik het FITC-kanaal om de cel te identificeren. Klik op Selecties uit de vrije hand om de vrije selectietool te gebruiken om een interessant gebied binnen het cytoplasma te selecteren en de magnetische microbead te vermijden. Deze regio van belang mag de kern niet omvatten.
    6. Klik op Analyseren > meten in het FITC-kanaal. De gemeten waarde van het gemiddelde is de gemiddelde cytoplasmatische YAP-intensiteit DC.
    7. Bereken de YAP N/C ratio = DN / DC.
  2. Kwantificering van nucleaire vorm en genormaliseerde kernvlekintensiteit
    1. Open Fiji ImageJ. Open de .nd2-afbeeldingen die in stap 5 zijn gemaakt.
    2. Klik op Analyseren > Metingen instellen. Controleer gebied, geïntegreerde dichtheid, gemiddelde grijswaarde en vormbeschrijvingen.
    3. Gebruik het Cy5-kanaal om de kern te identificeren. Klik op Freehand Selections om de vrije selectietool te gebruiken om de kern te schetsen.
    4. Klik op Analyseren > Meten in Cy5 kanaal. De gemeten waarde van het gemiddelde is de intensiteit van de kernvlek. De gemeten waarde van Circ. is nucleaire circulariteit.
    5. Om de kernvlekintensiteit bij verschillende krachttoestanden te vergelijken, wordt alle kernvlekintensiteit gedeeld door de kernvlekintensiteit in "before_small_force.nd2" om de genormaliseerde kernvlekintensiteit te genereren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ontwerp van een magneetbewegend apparaat en toepassing van magnetische kracht
Om kracht uit te oefenen op de kern door de magnetische microbeads, werd een magneetbewegend apparaat ontworpen en gebouwd om de ruimtelijke positie van de magneet te regelen. Het magneetbewegende apparaat bevat een centraal frame, drie knoppen en rails om de aangesloten magneet onafhankelijk van elkaar in x-, y- en z-richting te bewegen met een ruimtelijke resolutie van 1,59 mm per cyclus (figuur 1A). Zodra de magneet in de buurt van de microbeads van 7 μm wordt gebracht die in de cellen worden afgeleverd (figuur 1B), trekt deze magnetisch de microbeads aan en oefent kracht uit op de kern (figuur 1C). De krachtrichting en magnitude worden bepaald door de relatieve positie tussen de magneet en microbeads.

In dit artikel werden twee verschillende groottes van kracht uitgeoefend op de microbeads: (1) een relatief kleine kracht wanneer de magneet 46 mm boven de cel werd geplaatst; en (2) een relatief grote kracht wanneer de magneet 13 mm boven de cel werd geplaatst. De magnetische kracht die op de microbead F wordt uitgeoefend, kan worden berekend met de vergelijking59: Equation 1, waarbij Nd de demagnetiserende factor is (0,33 voor een bol), μ de permeabiliteit in een vacuüm is (6,3 × 10-3 H/m voor ijzer), Vp het volume van de microbead (178 μm3 voor een microbead van 7 μm), en H is de intensiteit van het magnetisch veld met de eenheid A/m. H is evenredig met de magnetische fluxdichtheid B met eenheid Tesla. Aangezien de magnetische kracht die inwerkt op een enkele microbead van 7 μm naar verwachting extreem klein en moeilijk te detecteren zou zijn door een krachtomvormer, werd de magnetische fluxdichtheid B als referentie gemeten om de grootte van de magnetische kracht aan te geven die op de microbeads werd uitgeoefend. Een Hall-sensor werd geïntroduceerd op de locatie van de bodem van de petrischaal om de magnetische fluxdichtheid te meten en de magneet werd op een afstand van 13 mm of 46 mm van de bodem van de petrischaal geplaatst. Omdat de microbeads van 7 μm het magnetisch veld beïnvloeden, werd de magnetische fluxdichtheid gemeten met en zonder microbeads. Ongeacht de aanwezigheid van de microbeads van 7 μm werd dezelfde magnetische fluxdichtheid verkregen: B = 60,1 mT op een afstand van 13 mm en B = 3,7 mT op een afstand van 46 mm. Deze meting toont aan dat het effect van 7 μm microbeads op het magnetisch veld gegenereerd door de cilindrische magneet met een diameter van 12,7 mm en een hoogte van 12,7 mm (zie de tabel met materialen) niet detecteerbaar was door de Hall-sensor die in dit onderzoek werd gebruikt. De magnetische fluxdichtheid in de behuizing met een afstand van 13 mm was echter ongeveer 16 keer hoger dan die met een afstand van 46 mm. Experimentele kalibratie van de magnetische kracht wordt beschreven in de volgende paragraaf (figuur 6).

Afgifte van magnetische microbeads in het cytoplasma
12 uur na het zaaien van cellen op de petrischaal met glazen bodem worden 7 μm microbeads toegevoegd aan het kweekmedium. Microbeads worden spontaan geïnternaliseerd door de cellen. Omdat de microbeads geen fluorescentie uitzenden onder laserexcitatie in fitc- of cy5-kanaal, kan de locatie van de geïnternaliseerde microbeads worden geïdentificeerd door de locatie van de donkere holte met de confocale beeldvorming van fluorescentie van YAP en kern. Zowel 2D- als 3D-beelden laten zien dat de microbead zich in het cytoplasma bevindt terwijl het zich buiten de kern bevindt (figuur 2).

De internalisatieniveaus van microbeads in de cellen zijn afhankelijk van de duur van de co-kweek van cellen en microbeads. De cellen werden dus gecategoriseerd in drie typen op basis van de hoeveelheid geïnternaliseerde microbeads - geen microbead, enkele microbead en multi-microbeads (figuur 3A). Na 7 uur co-kweek internaliseerde 62% van de cellen geen microbead, 15% van de cellen internaliseerde een enkele microbead en 23% van de cellen internaliseerde multi-microbeads (totaal aantal cellen = 13). Na 12 uur co-kweek internaliseerde 53% van de cellen geen microbead, 26% van de cellen internaliseerde een enkele microbead en 21% van de cellen geïnternaliseerde multi-microbeads (totaal aantal cellen = 62). Na 24 uur co-kweek internaliseerde 20% van de cellen geen microbead, 28% van de cellen internaliseerde een enkele microbead en 53% van de cellen internaliseerde multi-microbeads (totaal aantal cellen = 40) (figuur 3B).

Microbeads in cytoplasma hebben geen invloed op de nucleaire vorm en YAP-activiteit
Om het effect van de internalisatie van microbeads op de nucleaire vorm en eiwitactiviteit te onderzoeken, werd de nucleaire vorm eerst gekwantificeerd door respectievelijk circulariteit en de YAP-activiteit door YAP N / C-ratio. Circulariteit wordt berekend door Circulariteit = 4μ (oppervlakte / omtrek2). De gedetailleerde stappen om de YAP N/C-ratio te kwantificeren werden beschreven in een eerdere publicatie60. In het kort werd de YAP N/C-ratio berekend door de gemiddelde YAP-intensiteit in de kern te delen door de gemiddelde YAP-intensiteit in het cytoplasma. Gezien de mogelijkheid dat co-kweek van microbeads en cellen de nucleaire vorm kan beïnvloeden, zelfs als er geen microbead wordt geïnternaliseerd, de cellen zonder co-cultuur (zwarte stippen, controle # 1, Circulariteit = 0,806 ± 0,037, n = 20), cellen geco-gekweekt met microbeads maar zonder internalisatie (grijze stippen, controle # 2, Circulariteit = 0,806 ± 0,035, n = 22), cellen internaliseren enkele microbead (rode stippen, enkele microbead, Circulariteit = 0,793 ± 0,048, n = 15) en cellen die multi-microbeads internaliseren (blauwe stippen, multi-microbeads, n = 7) (figuur 3C) werden vergeleken. Het resultaat laat zien dat van alle vier de geteste groepen nucleaire circulariteit geen significant verschil had (figuur 3C).

Vervolgens, om te onderzoeken of de YAP N / C-ratio wordt beïnvloed door de internalisatie van microbeads, werden de cellen die samen met microbeads zijn gekweekt, maar zonder internalisatie (grijze stippen, controle # 2, YAP N / C-ratio = 1,155 ± 0,074, n = 35) alleen vergeleken met de cellen met enkele of multi-microbead internalisatie (rode stippen, cel met microbeads, YAP N / C-ratio = 1,140 ± 0,078, n = 36) op het12e uur van co-cultuur (figuur 3D). De cellen zonder co-kweek werden niet vergeleken omdat het gerecht met microbeads een lagere celdichtheid vertoont, wat de YAP N / C-verhouding12 kan beïnvloeden. Het resultaat toont geen significant verschil (p-waarde = 0,667) in de YAP N/C-verhouding tussen de twee groepen, wat aangeeft dat de internalisatie van microbeads de YAP-activiteit niet beïnvloedt (figuur 3D).

Magnetische kracht vervormt de kern
Eerst wordt de vervorming van de kern getoond. De vervorming van de kern wordt veroorzaakt door de compressiekracht die wordt uitgeoefend door de microbeads (figuur 4A en figuur 4A1-3) in cellen die cytoskelet bevatten. Deze gegevens (d.w.z. de kern wordt vervormd door de compressie van de microbead) ondersteunen dat de microbead inderdaad een kracht uitoefent op de kern in het overvolle cytoplasma. Een bright-field video die het proces van het aanbrengen van kracht laat zien, is opgenomen in het supplementmateriaal (aanvullende video 1). Ten tweede, omdat het mogelijk is dat de microbead tegelijkertijd kracht uitoefent op het omringende cytoskelet en de kern indirect vervormt, werden de compressie-experimenten herhaald in cellen met de verstoorde actinefilamenten (behandeling van Cyto D (2,5 μM, 1 uur); Figuur 4B). Deze studie toont aan dat de actinefilamenten inderdaad gedepolymeriseerd zijn (figuur 4B) en dat de kern wordt vervormd door de microbeads (figuur 4B1-3). Deze gegevens ondersteunen dat de microbeads een kracht rechtstreeks op de kern uitoefenen in afwezigheid van verweven omringend cytoskelet. Gezamenlijk laten deze gegevens zien dat de protocollen en hulpmiddelen een kracht rechtstreeks op de kern kunnen uitoefenen.

Ruimtelijke en temporele controle van intracellulaire magnetische microbeads
Om ruimtelijke controle van de microbeads te bereiken, werden een paar magneten gebruikt om de microbead te verplaatsen en de locatie van de inkeping op de kern te regelen (figuur 5A). De kraal kan alleen worden verplaatst met maximaal 2,2 μm verplaatsing (figuur 5A1-4), maar kan flexibel inkepingen op de kern toepassen op overeenkomstige locaties. Het omringende actinecytoskelet kan de beweging van microbeads beperken. Daarom werd het actinecytoskelet verstoord door Cyto D-behandeling (2,5 μM, 1 uur) en werd de microbeadlocatie gemanipuleerd, maar vertoonde vergelijkbare resultaten. Daarom kan een hypothese worden voorgesteld: de microbead kan fysisch/chemisch binden met de kern en andere omliggende organellen in het cytoplasma, wat de grote ruimtelijke beweging beperkt (>2,2 μm).

Om ruimtelijke controle van de microbeads te bereiken, werd een paar magneten gebruikt die de microbeads besturen om de kracht tweemaal (met verschillende krachtgrootte) op dezelfde locatie van de kern toe te passen en vrij te geven (figuur 5B en figuur 5B1-B4). De huidige tijdsduur voor één cyclus van krachttoediening en loslaten is 12 s. De snelheid van de temporele controle wordt bepaald door de bedrijfssnelheid van de XYZ-mover.

Kalibratie van de magnetische kracht
De op de kern uitgeoefende kraalkracht werd geschat door experimenteel de kracht te meten die wordt uitgeoefend door een gekalibreerde atoomkrachtmicroscopie (AFM) die een vergelijkbare vervorming van de kern veroorzaakt. In het bijzonder werd het actinecytoskelet voor het eerst opgelost door CytoD (2,5 μM; 1 uur, figuur 4B) omdat de AFM kracht uitoefent op het apicale oppervlak van de cel en de verwijdering van actineschors en cytoskelet zorgt voor meer direct contact tussen AFM-tip en celkern. De cellen waarvan de actine cortex en het cytoskelet zijn opgelost, leven op basis van de vergelijking van nucleaire vorm en nucleaire kleuringsintensiteit met die in gezonde cellen (aanvullende figuur 1). Ten tweede werd de niet-gefunctionaliseerde AFM-tip (semi-bolvormig, straal = 5 μm) die een vergelijkbare grootte en vorm heeft als die van de microbeads gebruikt om het apicale oppervlak van de cel op een krachtgestuurde manier in te laten inspringen en tegelijkertijd 3D-confocale beelden van de cel- en kernlichamen te verkrijgen (figuur 6A). De magnitude van de drukkracht van 0,8 nN tot 2,0 nN werd gekozen omdat, op basis van de literatuur24, kracht met een magnitude van 1,5 nN bekend was om de kern voldoende te vervormen. Ten derde werd de normale vervorming van de kern die werd veroorzaakt door de AFM-inkeping gemeten door middel van kwantitatieve beeldvormingsanalyse. Ook werd de kalibratiecurve verkregen die de kwantitatieve AFM-krachtverplaatsingsrelatie biedt (figuur 6B). Ten vierde werd een drukkracht uitgeoefend op het laterale oppervlak van de kern door microparels te besturen die een vergelijkbare grootte en vorm hebben (straal = 7 μm; Figuur 6C), en de vervorming van het kernmembraan werd gemeten via beeldvormingsanalyse. De door beads uitgeoefende kracht wordt geschat op basis van de AFM-kracht-verplaatsingsrelatie.

In figuur 6C is de vervorming van de kern veroorzaakt door magnetische microbeads (diameter = ~7 μm) bij 'grote kracht' bijvoorbeeld ongeveer 1,5 μm. In figuur 6D werd een AFM-tip met een halfronde sonde van 5 μm gebruikt om de cel bovenop de kern in te laten inspringen om 1,5 μm nucleaire vervorming te bereiken. De overeenkomstige kracht geregistreerd door AFM is 1,4 nN. Vandaar dat de kracht die door de microbeads wordt uitgeoefend wordt geschat op ~ 1,4 nN. Volgens dezelfde benadering wordt de magnetische kracht bij 'kleine kracht' gekalibreerd als 0,8 nN en veroorzaakte deze 0,4 μm nucleaire inkeping.

Deze studie is van mening dat de afm-gemeten kracht de microbead-toegepaste kracht kan vertegenwoordigen op basis van de volgende aannames: (1) De stijfheid van de kern in verschillende cellen is vergelijkbaar. (2) De mechanische eigenschappen van de kern zijn niet afhankelijk van de nucleaire locaties waarop de inkeping is toegepast. De magnetische kracht wordt horizontaal uitgeoefend op de laterale zijden van de kern, terwijl de AFM-kracht verticaal wordt uitgeoefend op de apicale zijden van de kern. Het mechanische verschil tussen hen wordt als verwaarloosbaar beschouwd. (3) In AFM-experimenten oefent de sonde rechtstreeks kracht uit door het celmembraan en cytoskelet op de kern. Na het verstoren van de actinefilamenten is de afm-uitgeoefende kracht op de kern vergelijkbaar met de microbeads-uitgeoefende kracht op de kern, ondanks het membraan dat zich in het eerste geval nog steeds tussen de AFM-sonde en de kern bevindt.

Magnetische kracht veroorzaakt verandering van YAP N / C-verhouding
Om te bewijzen dat de magnetische kracht die op de microbeads wordt uitgeoefend de kern kan vervormen en YAP-translocatie kan induceren, werd de YAP N / C-verhouding van de cellen met microbeads-internalisatie in drie fasen gekwantificeerd: (1) vóór het uitoefenen van de kracht, (2) na het uitoefenen van de kracht en (3) na het vrijgeven van de kracht. Sommige cellen vertoonden een verandering van nucleaire vorm en YAP N/C-verhouding wanneer de kracht werd uitgeoefend of vrijgegeven (figuur 7A,C). De intensiteitsveranderingen in YAP kunnen worden toegeschreven door twee mogelijke mechanismen: (1) YAP-FP-eiwitten transloceren van het cytoplasma naar de kern na krachttoepassing. In dit geval zou nucleaire kleuring geen signaalveranderingen moeten vertonen. De intensiteit van de nucleaire kleuring mag niet grotendeels veranderen; (2) YAP-FP-eiwitten transloceren niet na het aanbrengen van de kracht. De waargenomen YAP-intensiteitsveranderingen zijn te wijten aan de door kracht geïnduceerde nucleaire volumeverandering en de resulterende YAP-FP-concentratieverandering. In dit geval zou de intensiteit van de nucleaire kleuring moeten veranderen in een vergelijkbare trend als de YAP-kernintensiteit, omdat de concentratie van kleurstof ook verandert naarmate het kernvolume verandert. Daarom werd de verandering van de intensiteit van de nucleaire kleuring van het rode kanaal (excitatie: 650 nm; emissie: 681 nm) gemeten. De intensiteit verandert in YAP in het groene kanaal, maar er zijn geen intensiteitsveranderingen in kernkleuring in het rode kanaal. Het eerste mechanisme bestaat dus waarschijnlijk (figuur 7B). Gezamenlijk tonen de resultaten aan dat de door magnetische kracht geïnduceerde nucleaire vervorming YAP-translocatie veroorzaakt.

Vervolgens werd de nettoverandering van de YAP N/C-verhouding gekwantificeerd binnen twee groepen cellen: (1) cellen zonder microbead geïnternaliseerd (grijze stippen, controle, n = 9); en (2) geselecteerde cellen met geïnternaliseerde microbead(s) die een verandering van YAP N/C-verhouding vertonen (groene stippen voor kleine kracht, rode stippen voor grote kracht, n = 11). Bij 0,8 nN kracht vertonen cellen met geïnternaliseerde microbead(s) netto YAP N/C ratio verandering = -0,030 ± 0,029, n = 11; controlecellen tonen netto YAP N/C-verhoudingsverandering = -0,003 ± 0,012, n = 9. Bij 1,4 nN kracht vertonen cellen met geïnternaliseerde microbead(s) netto YAP N/C ratio verandering = 0,011 ± 0,040, n = 11; controlecellen tonen netto YAP N/C-verhoudingsverandering = 0,005 ± 0,005, n = 9 (figuur 8A). Bij 0,8 nN kracht vertonen cellen met geïnternaliseerde microbead(s) absolute netto YAP N/C ratio verandering = 0,057 ± 0,017, n = 11; controlecellen tonen netto YAP N/C-verhoudingsverandering = 0,021 ± 0,007, n = 9. Het verschil is significant (p-waarde = 0,0093, **). Bij 1,4 nN kracht vertonen cellen met geïnternaliseerde microbead(s) absolute netto YAP N/C ratio verandering = 0,070 ± 0,020, n = 11; controlecellen tonen netto YAP N/C-verhoudingsverandering = 0,010 ± 0,003, n = 9. Het verschil is significant (p-waarde = 0,0007, ***) (figuur 8B). Samen bevestigen deze resultaten dat de magnetische kracht die wordt uitgeoefend op de microbeads in het cytoplasma inderdaad YAP-translocatie kan induceren en de YAP N / C-verhouding kan veranderen.

Figure 1
Figuur 1: Ontwerp van het magnetische bewegende apparaat en schematische krachttoepassing in de cel door magnetische microbeads. (A) Driedimensionaal schema van het apparaat geïmplementeerd om de magneet vast te houden en in x-, y- en z-richtingen te bewegen. Het apparaat bestaat uit een basis van 241,3 mm breed en 104,1 mm hoog, twee knoppen, een staaf en een magneet. De knoppen worden gespalkt in de juiste draairichting, wat beweging in de overeenkomstige richting zal leveren. De magneet wordt dichter bij de schotel neergelaten/verhoogd om magnetische kracht met verschillende grootte en richting op magnetische microbeads toe te passen. (B) Voorbeeld scanning elektronenmicroscoop (SEM) afbeelding van 7 μm ijzer microbead. (C) Magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgegeven, kunnen kracht uitoefenen op de organellen zoals de kern wanneer een magnetisch veld wordt toegepast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Representatieve beelden van magnetisch microbead (zwarte holte gericht door blauwe pijl) wordt geïnternaliseerd in de cel (aangegeven door YAP) en buiten de kern. (A) X-Y doorsnede van een cel van YAP (groen), kern (rood) en helder veld. (B) 3D-reconstructie van de cel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Microbeads geïnternaliseerd door de cellen hebben geen invloed op de nucleaire vorm en YAP N / C-ratio. (A) Representatieve bright-field en fluorescentiebeelden van cellen zonder microbead, single microbead en multi-microbead internalisatie. Blauwe pijlen geven de positie van microbeads in het cytoplasma aan. (B) Bij 7 h (n = 13), 12 h (n = 62) en 24 h (n = 40) co-cultuur, het percentage cellen dat geen microbead, single microbead en multi-microbead internalisatie vertoont. (C) Nucleaire circulariteit toont geen significant verschil tussen controlecellen en cellen met microbead internalisatie. Controle #1 (zonder microbead co-cultuur): Circulariteit = 0,806 ± 0,037, n = 20; Controle #2 (met microbead co-kweek, zonder microbead internalisatie): Circulariteit = 0,806 ± 0,035, n = 22; Internalisatie van enkele microbead: Circulariteit = 0,793 ± 0,048, n = 15; multi-microbead internalisatie: Circulariteit = 0,780 ± 0,061, n = 7. (D) YAP N/C-ratio vertoont geen significant verschil (p-waarde = 0,667) tussen controlecellen (met microbead-cocultuur, zonder microbead-internalisatie, YAP N/C-ratio = 1,155 ± 0,074, n = 35) en cellen met microbead-internalisatie (YAP N/C-ratio = 1,140 ± 0,078, n = 36). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Directe krachttoediening op kern met en zonder actinefilamenten. (A) Cellen vertonen actinefilamenten (geel). (A1) Afbeelding van de kern wanneer er geen kracht wordt uitgeoefend. (A2) Afbeelding van de kern nadat de kracht is uitgeoefend. (A3) Overlapbeeld van de nucleaire grens voor en na de krachttoepassing toont nucleaire inkeping. (B) Cellen vertonen verstoorde actinefilamenten (geel) na cyto D-behandeling (2,5 μM, 1 uur). (B1) Afbeelding van de kern wanneer er geen kracht wordt uitgeoefend. (B2) Afbeelding van de kern nadat de kracht is uitgeoefend. (B3) Overlapbeeld van de nucleaire grens voor en na de krachttoepassing toont nucleaire inkeping met het verstoorde actinecytoskelet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Ruimtelijke en temporele controle van intracellulaire magnetische microbead. (A) Een paar magneten bestuurt ruimtelijk de magnetische microbead. (A1) Helderveldbeeld van celgrens (groene lijn), nucleaire grens (rode lijn) en magnetisch microbead (gele lijn) op positie 1. (A2) Magnetisch microbead springt kern in op positie 1. (A3) Magnetisch microbead wordt verplaatst naar positie 2 (gele lijn). Positie 1 wordt weergegeven als referentie (gele stippellijn). (A4) Magnetisch microbead trekt kern in op positie 2. (B) Een paar magneten regelt tijdelijk magnetisch microbead. (B1) Bright-field beeld van een cel zonder kracht toegepast op tijdstip I. (B2) Magnetisch microbead brengt een kracht aan op de kern op tijdstip II. (B3) Magnetisch microbead geeft de kracht vrij uit de kern op tijdstip III. (B4) Magnetisch microbead oefent een grotere kracht uit op de kern op tijdstip IV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6. Kalibratie van de door microbead uitgeoefende kracht op de kern met behulp van AFM-inkeping. (A) Schematische illustratie van het kalibratieproces. Magnetische microbead past horizontale compressie toe op de kern (links) en AFM-sonde springt verticaal in op de kern. (B) AFM-inspringingskracht versus nucleaire vervorming. (C) Representatief beeld van kernvervorming (1,5 μm) voor en na krachttoepassing door magnetisch microbead. (D) Representatief beeld van vergelijkbare kernvervorming (1,5 μm) voor en na AFM-inkeping met 1,4 nN-kracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Representatieve gegevens waaruit blijkt dat de verandering van de YAP N/C-verhouding wordt geïnduceerd door magnetische krachttoepassing en -afgifte. (A) X-Y-doorsnede van YAP (groen) en kern (rood) fluorescerend beeld van de cel zonder kracht, kracht aan en kracht uit. In de force-on conditie neemt de cytoplasmatische YAP-intensiteit af op de locatie die wordt aangeduid met een gele pijl, terwijl de nucleaire YAP-intensiteit toeneemt. YAP N/C ratio neemt toe. (B) Yap N/C-ratio neemt toe wanneer de kracht wordt ingeschakeld (van 1,0791 tot 1,2327) en neemt af wanneer de force off (van 1,2327 tot 1,1548). Genormaliseerde kernvlekintensiteit vertoont een kleine verandering bij krachttoediening (1,00117) en loslaten (0,95578). (C) X-Z doorsnede van YAP (groen) en kern (rood) afbeelding van de cel zonder kracht, force on en force off. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: YAP N/C-verhoudingsverandering geïnduceerd door magnetische krachttoepassing. (A) Bij 0,8 nN kracht vertonen cellen met geïnternaliseerde microbead(s) netto YAP N/C ratio verandering = -0,030 ± 0,029, n = 11; controlecellen tonen netto YAP N/C-verhoudingsverandering = -0,003 ± 0,012, n = 9. Bij 1,4 nN kracht vertonen cellen met geïnternaliseerde microbead(s) netto YAP N/C ratio verandering = 0,011 ± 0,040, n = 11; controlecellen tonen netto YAP N/C ratio verandering = 0,005 ± 0,005, n = 9. (B) Bij 0,8 nN kracht vertonen cellen met geïnternaliseerde microbead(s) absolute netto YAP N/C ratio verandering = 0,057 ± 0,017, n = 11; controlecellen tonen netto YAP N/C-verhoudingsverandering = 0,021 ± 0,007, n = 9. Het verschil is significant (p-waarde = 0,0093, **). Bij 1,4 nN kracht vertonen cellen met geïnternaliseerde microbead(s) absolute netto YAP N/C ratio verandering = 0,070 ± 0,020, n = 11; controlecellen tonen netto YAP N/C-verhoudingsverandering = 0,010 ± 0,003, n = 9. Het verschil is significant (p-waarde = 0,0007, ***) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Nucleaire vorm en nucleaire kleuringsintensiteit. (A) Zonder Cyto D behandeling, (B) Met Cyto D behandeling en (C) Dode cel. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 1: Een heldere video die het proces voor het aanbrengen van kracht laat zien. Klik hier om deze video te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Internalisatie van magnetische microbeads (sectie 2.2) is van cruciaal belang omdat extracellulaire microbeads niet rechtstreeks kracht kunnen uitoefenen op de kern. Krachttoepassing en beeldvorming (paragraaf 5.3) zijn kritieke stappen in dit experiment en de kracht die nodig is om de kern te vervormen en zinvolle biologische gevolgen te veroorzaken, kan steekproefafhankelijk zijn. De krachtmagnitude in dit experiment (0,8 nN en 1,4 nN) kan verder worden verhoogd om nucleaire mechano-detectie in minder gevoelige cellen te activeren.

Om magnetische kracht op een kwantitatieve manier toe te passen met een hoge doorvoer, is de internalisatie van een enkele microbead een ideale aanpak. In deze studie was het percentage cellen met single-microbead internalisatie vergelijkbaar met 12 h (26%) en 24 h (28%), terwijl de cellen zonder microbead internalisatie hoger waren na 12 h (53%) dan die na 24 h (20%) (Figuur 3B). Er wordt van uitgegaan dat 12 uur de optimale tijd is voor krachttoepassingsexperimenten omdat meer enkele microbeads kunnen worden opgenomen en cellen kunnen worden gecontroleerd. Voor verschillende cellijnen en microbeadgroottes moeten co-kweektijd en microbeadconcentratie worden getest om de overeenkomstige optimale omstandigheden te bepalen.

In de experimenten werden de microbeads niet gecoat om specifiek aan de kern te binden. Daarom is de kracht die rechtstreeks van de microbeads naar de kern wordt overgebracht waarschijnlijk alleen comprimerend. De resultaten laten zien dat de YAP N/C-ratio de celpopulatie verhoogt en verlaagt (figuur 8A). Een mogelijke reden is dat de magnetische kracht die via de microbeads wordt uitgeoefend, positieve of negatieve spanningsverandering in het cytoskelet kan veroorzaken en de YAP N / C-verhouding kan reguleren om te stijgen of te dalen, respectievelijk28. Eerder onderzoek toont aan dat drukkracht op de kern een toename van de YAP N/C-verhouding28 induceert. In toekomstige experimenten, om de directe krachtdetectie van de kern te bestuderen, kan het cytoskelet worden verstoord om de krachtoverdracht van het cytoskelet naar de kern te elimineren.

Er zijn twee potentiële nadelen in de huidige methoden. Ten eerste werd in deze experimenten de 3D-mover (figuur 1A) gebruikt om de beweging van de kralen aan te passen, die wordt bewaakt door real-time confocale beeldvorming en tot doel heeft een drukkracht op de kern uit te oefenen. Vanwege de gladde aard van het kernmembraan en de complexe omgeving in het cytoplasma, is de richting van de door de kralen uitgeoefende kracht echter niet puur compressief (d.w.z. niet absoluut loodrecht op het kernmembraanoppervlak). Deze onvolkomenheid kan ervoor zorgen dat er een schuifkracht op het kernmembraan wordt uitgeoefend. Ten tweede zijn de huidige microbeads die in deze studie worden gebruikt niet geconjugeerd met het antilichaam om te binden met de kern, omdat de ruimtelijke mobiliteit van de kralen van cruciaal belang is in het huidige experiment om het voordeel van contactloze magnetische actuator aan te tonen. Daarom kan de huidige methode geen spanning uitoefenen op het kernmembraan.

In de toekomst zullen (1) kralen met anti-nesprin-1 antilichaam worden geconjugeerd om specifiek met de kern te binden. Dit kan de directe en specifieke krachtoverdracht tussen microbeads en de doeleiwitten garanderen. (2) De richting van de kracht wordt gekalibreerd door de enkele magnetische microbead te manipuleren in zachte hydrogel ingebed met fluorescerende kralen. De 3D-verplaatsing van fluorescerende kralen kan worden gebruikt om het vervormingsveld van de hydrogel te berekenen en de krachtrichting te bepalen als functie van het toegepaste magnetische veld. Nadat de microbead chemisch is gebonden met de kern, zal het uitoefenen van een kracht met een bekende richting het krachttype bepalen (spanning, compressie of afschuiving). (3) De 3D-beeldvorming van nucleaire kleuring zal worden gebruikt om een 3D-simulatie FEM-model van de kern te bouwen. De krachtrichting kan worden geverifieerd door de kernvervorming voor en na de magnetische krachttoepassing te vergelijken.

De unieke techniek die in deze studie is ontwikkeld, biedt verschillende potentiële voordelen: (1) In vergelijking met verticale inkeping door AFM-sondes kunnen magnetische microbeads in elke richting kracht uitoefenen. Cellen gekweekt op 2D-substraatoppervlakken kunnen heterogene eiwitverdeling en oriëntatie hebben op hun verticale en horizontale oppervlakken van het plasmamembraan en de nucleaire envelop. Het horizontaal uitoefenen van kracht kan eerder niet-geobserveerde mechano-detectiereacties veroorzaken. (2) Zodra de microbeads functioneel zijn gecoat om aan de kernen te binden, kunnen zowel duw- als trekkrachten rechtstreeks op de kern worden uitgeoefend om de differentiële nucleaire mechano-detectie verder te bestuderen vanwege de verschillende krachtrichtingen. (3) Door de specifieke binding van microbeads aan bepaalde eiwitten uit de nucleaire enveloppe te regelen, kunnen eerder onderbelichte mechanismen voor kernkrachtdetectie worden opgehelderd. Opkomend bewijs toont aan dat de kern waarschijnlijk een mechano-sensor36 is, en nucleaire mechano-detectie is de meest directe regulator van YAP-translocatie28. Het mechanisme van nucleair gereguleerde YAP-translocatie wordt actief bestudeerd en verschillende kandidaten van mechano-sensor of parameters in de kern worden voorgesteld, waaronder nucleaire poriegrootte28, nucleaire vorm25,61, LINC-complex en nucleaire envelopspanning20. Het manipuleren van de magnetische microbeads opent de mogelijkheid voor gedetailleerde verkenning van dergelijke mechanismen door directe krachttoepassing op het LINC-complex en gecontroleerde voorschriften van de spanning en vorm van de nucleaire enveloppen. (4) Naast het uitoefenen van krachten op de kern, zijn microbeads ook geschikt om te worden ontworpen om aan de binnenkant van het plasmamembraan te binden om te onthullen hoe de intracellulaire domeinen van membraaneiwitten en hun complex reageren op biofysische signalen.

Samenvattend demonstreerde dit artikel een methode die (1) ijzermicro-microbeads van microformaat in cytoplasma levert zonder de nucleaire morfologie en eiwitfuncties te beïnvloeden, (2) kracht uitoefent op de kern door magnetische microbeads en (3) confocale fluorescentie live-cell imaging uitvoert tijdens de krachttoepassing. Deze niet-invasieve hulpmiddelen openen de mogelijkheden voor directe epigenetische manipulatie van organellen in enkele cellen, superresolutie-imaging-gebaseerde ondervraging van nucleusmechanotransductie en gedetailleerde verkenning van krachtgereguleerde 3D-chromosoomorganisatie (in combinatie met Hi-C: hoge resolutie chromosoombevestigingsvangst) en herprogrammering in de contexten van celfysiologie en pathobiologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er zijn geen belangenconflicten aan te kondigen.

Acknowledgments

Dit project wordt gefinancierd door UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), de UFHCC Pilot Award (X. T. en Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) en UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). We waarderen oprecht de intellectuele discussies met en de technische ondersteuning van Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE &ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurochirurgie), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (Universiteit van Arizona), en ondersteuningsteam van Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon en Jon Ekman). We zijn zeer dankbaar voor de effectieve steun van alle leden van Tang's, Yamaguchi's, Sharma's, Au's, Siemann's en Guan's onderzoekslaboratoria en alle medewerkers van de UF MAE-afdeling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , Springer. Boston, MA. 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Tags

Biologie Nummer 185 Nucleus mechanobiologie magnetische kracht CRISPR/Cas9 mechanotransductie zachte actieve materie ja-geassocieerd eiwit (YAP) fluorescerende functionele beeldvorming digitale beeldvormingsverwerking optogenetica epigenetica
Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., … More

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter