Summary
Aqui, desenvolvemos um modelo de célula muscular lisa da aorta humana organ-on-a-chip para replicar a cepa biomecânica in vivo de células musculares lisas na parede da aorta humana.
Abstract
Técnicas convencionais de cultura de células bidimensionais e modelos animais têm sido utilizados no estudo do aneurisma e dissecção da aorta torácica humana (TAAD). No entanto, o TAAD humano às vezes não pode ser caracterizado por modelos animais. Há uma aparente lacuna de espécies entre estudos clínicos em humanos e experimentos com animais que podem dificultar a descoberta de drogas terapêuticas. Em contraste, o modelo convencional de cultura celular é incapaz de simular estímulos biomecânicos in vivo. Para este fim, a microfabricação e as técnicas microfluídicas se desenvolveram muito nos últimos anos, fornecendo novas técnicas para o estabelecimento de modelos de organoides em um chip que replicam o microambiente biomecânico. Neste estudo, um modelo de célula muscular lisa da aorta humana organ-on-a-chip (HASMC-OOC) foi desenvolvido para simular os parâmetros fisiopatológicos da biomecânica da aorta, incluindo a amplitude e a frequência da tensão cíclica experimentada pelas células musculares lisas da aorta humana (HASMCs) que desempenham um papel vital no TAAD. Nesse modelo, a morfologia dos CMHHs tornou-se alongada, alinhada perpendicularmente à direção da deformação e apresentou fenótipo mais contrátil em condições de deformação do que em condições convencionais estáticas. Isso foi consistente com a orientação celular e o fenótipo nas paredes aórticas humanas nativas. Além disso, usando TAAD (BAV-TAAD) relacionados à válvula aórtica bicúspide (BAV-TAAD) e HASMCs primários derivados de TAAD (TAV-TAAD) relacionados à válvula aórtica tricúspide, estabelecemos modelos de doença BAV-TAAD e TAV-TAAD, que replicam as características do HASMC no TAAD. O modelo HASMC-OOC fornece uma nova plataforma in vitro que é complementar aos modelos animais para explorar ainda mais a patogênese do TAAD e descobrir alvos terapêuticos.
Introduction
O aneurisma e dissecção da aorta torácica (DAAT) é uma dilatação ou delaminação localizada da parede aórtica associada a alta morbidade e mortalidade1. As células musculares lisas da aorta humana (HASMCs) desempenham um papel vital na patogênese do TAAD. Os HASMCs não são células terminalmente diferenciadas, e os HASMCs retêm alta plasticidade, permitindo que eles mudem fenótipos em resposta a diferentes estímulos2. As CMSAP são submetidas principalmente à tensão de tração rítmica in vivo, sendo este um dos principais fatores reguladores das alterações morfológicas, diferenciação e funções fisiológicas do músculo liso 3,4. Portanto, o papel da cepa cíclica no estudo das CMHS não pode ser ignorado. No entanto, as culturas convencionais de células 2D não podem replicar a estimulação biomecânica da cepa cíclica experimentada pelos HASMCs in vivo. Além disso, a construção de um modelo de TAAD animal não é adequada para alguns tipos de TAAD, como o TAAD relacionado à válvula aórtica bicúspide (BAV). Além disso, a lacuna de espécies entre estudos clínicos em humanos e experimentos com animais não pode ser ignorada. Dificulta a tradução farmacêutica na prática clínica. Assim, há uma necessidade urgente de sistemas mais complexos e fisiológicos para simular o ambiente biomecânico in vivo na pesquisa de doenças da aorta.
Experimentos com animais usados em pesquisa biomédica e desenvolvimento de medicamentos são caros, demorados e eticamente questionáveis. Além disso, os resultados de estudos em animais frequentemente não conseguem prever os resultados obtidos em ensaios clínicos em humanos 5,6. A falta de modelos pré-clínicos humanos e a alta taxa de falha em ensaios clínicos têm resultado em poucos medicamentos eficazes para a clínica, o que tem aumentado os custos com a assistência à saúde7. Assim, é urgente encontrar outros modelos experimentais que complementem os modelos animais. As técnicas de microfabricação e microfluídica se desenvolveram muito nos últimos anos, fornecendo novas técnicas para o estabelecimento de modelos de organoides em um chip que corrigem as desvantagens das técnicas tradicionais de cultura de células 2D e estabelecem um modelo in vitro mais realista, de baixo custo e eficiente para estudos fisiológicos e desenvolvimento de medicamentos. Usando dispositivos microfluídicos, os órgãos em chips são estabelecidos para cultivar células vivas em câmaras do tamanho de micrômetros com diferentes estímulos para replicar as principais funções de um tecido ou órgão. O sistema consiste em microcanais microfluídicos únicos ou múltiplos, com um tipo de célula cultivada em uma câmara perfundida replicando funções de um tipo de tecido ou diferentes tipos de células cultivadas em membranas porosas para recriar interfaces entre diferentes tecidos. Os organoides microfluídicos combinados com células derivadas de pacientes têm a vantagem única de preencher a grande diferença de espécies entre os modelos de doenças de camundongos e humanos e superar as desvantagens da cultura tradicional de células 2D para pesquisa de mecanismos de doenças e descoberta de medicamentos. Com o rápido desenvolvimento da microfluídica nos últimos anos, os pesquisadores perceberam a utilidade de modelos in vitro organ-on-a-chip (OOC) replicando parâmetros biológicos complexos in vivo 8. Esses organoides microfluídicos simulam ambientes biomecânicos in vitro, como deformação cíclica, tensão de cisalhamento e pressão líquida, proporcionando um ambiente de cultura celular tridimensional (3D). Até o momento, vários modelos de OCO foram estabelecidos para simular estímulos biomecânicos em órgãos como o pulmão9, rim 10, fígado 11, intestino12 e coração 13, mas estes não têm sido amplamente aplicados ao estudo da doença aórtica humana.
Neste estudo, apresentamos um modelo de célula muscular lisa da aorta humana organ-on-a-chip (HASMC-OOC) que pode controlar as forças mecânicas biomiméticas e os ritmos aplicados aos HASMs primários derivados de pacientes com TAAD. O chip consiste em placas espessas de três camadas de polidimetilsiloxano (PDMS) gravadas com canais e duas membranas PDMS altamente flexíveis comercializadas. Os HASMCs são cultivados nas membranas do PDMS. O canal no meio do chip é preenchido com um meio de cultura para cultura celular. Os canais superior e inferior do chip são conectados a um sistema de fornecimento de pressão de vácuo que pode controlar o ritmo e a frequência da tensão de tração mecânica das membranas PDMS. A deformação rítmica experimentada pelos HASMCs pode ser simulada no HASMC-OOC, replicando o microambiente biomecânico de tecido ou órgão não funcionalmente alcançável com sistemas de cultura 2D convencionais. Com a vantagem de imagens de alta resolução, em tempo real e microambiente biomecânico, as atividades bioquímicas, genéticas e metabólicas das células vivas podem ser estudadas para o desenvolvimento de tecidos, fisiologia de órgãos, etiologia da doença, mecanismos moleculares e identificação de biomarcadores, doenças cardiovasculares e doenças da aorta. Combinado com células específicas de tecidos e pacientes, esse sistema pode ser usado para triagem de drogas, medicina personalizada e testes de toxicidade. Este modelo HASMC-OOC fornece uma nova plataforma in vitro para estudar a patogênese da doença aórtica.
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Protocol
Espécimes aórticos humanos foram utilizados para isolamento primário do HASMC sob a aprovação do Hospital Zhongshan, Comitê de Ética da Universidade de Fudan (NO. B2020-158). Espécimes de aorta foram coletados de pacientes submetidos à cirurgia de aorta ascendente no Hospital Zhongshan, Universidade de Fudan. O termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido de todos os pacientes antes da participação.
1. Isolamento primário das células musculares lisas da aorta humana
- Lavar a região lateral direita da aorta ascendente com PBS estéril, 1x-2x.
- Remova as camadas íntima e adventícia do tecido com duas pinças oftálmicas e retenha a camada média para colher as células.
- Coloque a camada média sobre um prato de cultura de 10 cm e corte-a em pedaços pequenos (2-3 mm) com uma tesoura. Adicionar 5 mL de meio de cultura de células musculares lisas (SMCM) contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina.
- Mova o pequeno tecido para o frasco de cultura com um conta-gotas estéril, espalhando o tecido uniformemente. Descarte o meio de cultura o máximo possível e, em seguida, inverta a garrafa de cabeça para baixo.
- Adicione 2 mL de SMCM no frasco de cultura invertido e coloque-o na incubadora (5% de CO 2) a 37 °C por 1-2 h, depois vire-o lentamente para o lado direito e adicione mais2 mL de SMCM.
- Após 5-7 dias de incubação, troque o SMCM por 4 mL de SMCM fresco. Geralmente, as células musculares lisas esporádicas saem em aproximadamente 2 semanas.
- Descarte lentamente o SMCM e adicione-o lentamente ao mudar o meio. Transportar o frasco de cultura lentamente ao se mover para uma estação de microscópio; caso contrário, os tecidos flutuarão e as células crescerão lentamente.
- Quando as células atingirem aproximadamente 80% de confluência, lavar com 2 mL de PBS, digerir com 2 mL de tripsina a 0,25% e dividi-las em dois novos frascos de cultura com 4 mL de SMCM fresco.
- Identificar as células através de uma análise de imunofluorescência de quatro diferentes marcadores específicos para células musculares lisas (CNN1, SM22)14.
2. Preparação do chip PDMS
- Para polimerizar o PDMS, adicionar o agente de cura (componente B) à base (componente A) a uma relação de peso de A: B = 10:1 p/p e misturar o complexo completamente por 5 min; o volume depende da necessidade do estudo.
- Coloque o gel PDMS preparado em um tanque de extração a vácuo por 30-60 min e mantenha a pressão abaixo de -0,8 mPa.
NOTA: A alta pressão levará à extração insuficiente de pequenas bolhas dentro do gel PDMS que afetarão a próxima etapa da fabricação de chips. - Usando o software de design assistido por computador (CAD), projete o molde com uma estrutura de estrutura externa de 100 mm × 40 mm × 8 mm e uma estrutura de estrutura externa de 70 mm × 6 mm × 4 mm.
- Personalize os moldes das três camadas usando uma máquina de gravação de controle numérico computadorizado de alta precisão. Esculpir a estrutura dos moldes e os microcanais usando placas de polimetilmetacrilato (PMMA) e, em seguida, colá-los em outra placa de PMMA.
- Despeje o gel PDMS preparado em um molde com um × de 100 mm × estrutura externa de 6 mm e 70 mm × canal de 6 mm × 4 mm e, em seguida, reticule a 70 °C por 1-2 h.
- Retire as placas PDMS reticuladas do molde e corte as membranas PDMS comercializadas em seções de 100 mm × 40 mm.
- Trate as três placas PDMS preparadas e duas membranas PDMS com plasma de oxigênio por 5 min para ativação da superfície PDMS. Aplique as seguintes configurações específicas: ar ambiente como gás de processo; pressão ajustada para -100 kPa; atual definido para 180--200 Ma; tensão ajustada para 200 V; tempo de processo até 5 min.
- Faça furos nas três lajes PDMS usando um perfurador de furo de 1 mm para fazer a entrada e saída de ar e microcanais médios no chip PDMS.
- Unir três lajes PDMS e duas membranas PDMS juntas na ordem: laje PDMS canal de ar (camada superior) - membrana PDMS - laje PDMS de canal médio (camada média) - membrana PDMS - laje PDMS canal de ar (camada inferior). Execute esta etapa sob um microscópio estereoscópico a 4x para sobrepor totalmente os microcanais de ar com os microcanais médios.
- Coloque o chip PDMS montado em uma incubadora de 70 °C por 1 h.
- Prepare várias mangueiras de látex de 1 mm de diâmetro interno e 3 cm de comprimento. Insira uma agulha de aço inoxidável de 1 mm de diâmetro externo e 1 cm de comprimento em uma extremidade da mangueira preparada e, em seguida, insira um Luer na outra extremidade da mangueira para criar o tubo conectado ao ar e aos microcanais médios do chip PDMS.
- Insira os tubos preparados nas saídas e entradas do ar e microcanais médios no chip PDMS.
3. Tratamento de superfície de cavaco PDMS e esterilização
- Infundir 2 ml de colagénio de rato de 80 mg/ml no microcanal médio do chip PDMS utilizando uma seringa de 2 ml e incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
- Após a incubação, retire o colágeno do canal e recupere com uma seringa de 2 mL. Coloque os cavacos PDMS revestidos de colagénio numa incubadora a 60 °C durante a noite.
- Coloque os chips PDMS em um esterilizador UV por mais de 1 h. Coloque os chips PDMS esterilizados em uma bancada ultralimpa em preparação para o experimento celular.
4. Semeadura de células no chip PDMS e processo de alongamento de células
- Cultura 4 x 10 5 células musculares lisas humanas primárias (HASMCs) de pacientes usando meio de células musculares lisas (SMCM) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina em uma incubadora de CO2 a5% a 37 °C.
- Quando a densidade do CMASA atingir 80%, descarte o SMCM e lave as células com 2 mL de PBS.
- Digerir as células usando 1 mL de tripsina a 0,25% por 2 min e centrifugar a 100 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de SMCM fresco. Use 8 mL de SMCM para cultivar as células em um prato de cultura de 10 cm.
- Calcule o número de células usando um citômetro e use as células em uma concentração final de 2 x 105 células/mL.
- Despeje lentamente 2 mL de PBS no microcanal médio do chip PDMS revestido de colágeno e esterilizado e descarte posteriormente usando uma seringa de 2 mL.
- Despeje lentamente um total de 2 mL de 2 x 105 células/mL de suspensão HASMC no microcanal médio do chip PDMS usando uma seringa de 2 mL. Em seguida, feche o Luer na entrada e saída do chip PDMS. Colocar o chip PDMS numa incubadora (5% CO2) a 37 °C durante 1 dia.
- Depois que as células estiverem conectadas à membrana PDMS no chip PDMS, quase após 24 h, conecte a saída do microcanal de ar no chip PDMS ao sistema controlador de vácuo. Quando a célula está ligada, uma forma celular alongada e normal pode ser vista sob o microscópio, contrastando com as células redondas suspensas.
- Ligue a válvula solenoide e a bomba de vácuo. Abra o regulador de vácuo e ajuste o nível de pressão para 10 kPa para 7,18 ± deformação de 0,44% e 15 kPa para 17,28 ± deformação de 0,91%.
- Após a definição dos parâmetros do sistema de controle, coloque os cavacos PDMS em uma incubadora (5% CO2) a 37 °C e estique por 24 h.
5. Preparação do sistema de controlo mecânico
- Prepare várias válvulas solenoides, filtros de vácuo, reguladores de vácuo, uma bomba de vácuo, uma bomba peristáltica e um controlador lógico programável (PLC) que controle a válvula solenoide.
- Programe o controlador PLC e defina o intervalo de tempo liga/desliga para 1 Hz. Conecte as válvulas solenoides ao controlador programado.
- Conecte a entrada da bomba de vácuo aos filtros de vácuo e, em seguida, conecte a saída dos filtros de vácuo aos reguladores de vácuo. Conecte a saída dos reguladores de vácuo às válvulas solenoides e, finalmente, conecte a saída das válvulas solenoides às saídas dos microcanais de ar dos chips PDMS.
- Conecte a saída da bomba peristáltica à entrada do microcanal médio do chip PDMS e a entrada da bomba peristáltica à saída do chip PDMS de microcanal médio para substituição do meio de cultura e manuseio de medicamentos.
- Ajuste a amplitude da deformação pelo regulador e a frequência da deformação pelo microcontrolador.
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Representative Results
O modelo HASMC-OOC consiste em um sistema de controle de vácuo, um sistema circulante e chips PDMS, e o projeto esquemático do modelo HASMC-OOC (Figura 1). O sistema de controle de vácuo consiste em uma bomba de vácuo, válvulas solenoides e um controlador PLC. Para atuar como o sistema circulante, uma bomba peristáltica foi usada para refrescar o meio de cultura celular e adicionar drogas. O chip PDMS foi composto por duas câmaras de vácuo e uma câmara média preenchida com SMCM para crescimento celular. De acordo com o projeto da estrutura do cavaco foi preparado o molde PMMA, e as três lajes PDMS foram preparadas por meio de despejo em moldes e reticulação a 70 °C por 2 h. Após o tratamento com plasma, as três placas PDMS e duas membranas PDMS foram unidas (Figura 2). Quando os chips PDMS foram preparados, os HASMCs foram cultivados na membrana PDMS no chip, e os chips PDMS foram conectados ao sistema de controle de vácuo e ao sistema circulante. Um esquema de todo o sistema é mostrado na Figura 1 Suplementar. Os parâmetros do chip PDMS são mostrados na Figura 3A e as propriedades mecânicas da membrana PDMS são mostradas na Figura 3B. Para quantificar as deformações de tração da membrana PDMS, capturamos as deformações em tempo real das membranas PDMS a partir de uma visão transversal do modelo microfluídico, com pressões de vácuo de 0 kPa, 10 kPa, 15 kPa, 20 kPa, 25 kPa e 30 kPa. Também foram medidas as mudanças no comprimento para avaliar a magnitude da deformação da membrana PDMS em diferentes larguras de canais de cultura de 2 mm, 4 mm e 6 mm (Figura 3C-E). Microcanais de 6 mm de largura foram utilizados no chip PDMS. Os resultados mostraram que uma pressão de vácuo de 10 kPa induziu 7,18 ± deformação de 0,44% e 15 kPa induziu 17,28 ± deformação de 0,91% (Figura 3E).
Para verificar a viabilidade celular da linhagem celular HASMC (CRL1999) no chip PDMS, um ensaio LIVE/DEAD foi realizado nos dias 3 e 5 após o cultivo das células. Os resultados mostraram que a viabilidade celular foi superior a 90% no dia 3 e no dia 5 (Figura 4A). A coloração do citoesqueleto (F-actina) da CRL1999 no chip PDMS mostrou morfologia celular normal e células alinhadas perpendicularmente à deformação após alongamento por 24 h (Figura 4B-C). A coloração por imunofluorescência dos marcadores contráteis SM22 e CNN1 foi realizada com HASMC-OOC após 24 h de deformação rítmica (Figura 4D-E). Para começar, 2 mL de PBS foram lentamente despejados no canal e descartados com uma seringa de 2 mL. Posteriormente, 2 mL de paraformaldeído a 4% (v/v) foram despejados no canal e incubados por 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, 2 mL de Triton X-100 a 0,2% (v/v) foram despejados no canal por uma seringa de 2 mL e incubados por 15 min à temperatura ambiente. Isto foi seguido por 2 mL de PBS sendo lentamente despejados no canal e descartados por uma seringa de 2 mL após a lavagem das células. Em seguida, 2 mL de albumina sérica bovina a 5% (p/v) foram lentamente despejados no canal e incubados por 30 min à temperatura ambiente. Posteriormente, 1 mL de anticorpo SM22 ou CNN1 foi lentamente despejado no canal e incubado durante a noite a 4 °C. Após a incubação, 1 mL de anticorpo secundário anti-coelho de cabra foi lentamente despejado no canal e incubado por 1 h à temperatura ambiente. Finalmente, 1 mL de solução de DAPI foi lentamente despejado no canal e incubado por 10 min à temperatura ambiente. Os resultados mostraram que a intensidade de fluorescência de SM22 e CNN1 em condições de deformação foi maior do que em condições estáticas (Figura 4F). Em comparação com as condições estáticas, os genes SM22 e CNN1 em HASMCs foram regulados positivamente em condições de deformação (Figura 4G). Esses dados sugeriram que o CRL1999 se alinhou perpendicularmente à direção da deformação e que um fenótipo contrátil foi mais pronunciado sob condições de deformação do que sob cultura celular convencional em condições estáticas.
Usando HASMCs primários derivados de TAAD (BAV-TAAD) relacionados à válvula aórtica bicúspide (TAV-TAAD) e TAAD (TAV-TAAD) relacionados à válvula aórtica tricúspide, estabelecemos modelos de doença BAV-TAAD e TAV-TAAD. Os resultados da coloração com actina F dos HASMC primários derivados do paciente BAV-TAAD e TAV-TAAD mostraram morfologia celular normal e células alinhadas perpendicularmente à direção da deformação após o alongamento por 24 h (Figura 5A-B). A coloração por imunofluorescência mostrou que a expressão de SM22 e CNN1 nas CMHCR primárias derivadas de pacientes com BAV-TAAD e TAV-TAAD foi maior sob condições de deformação do que em condições estáticas (Figura 5C-G,I). Os níveis de expressão gênica de SM22 e CNN1 em HASMs primários derivados de pacientes com BAV-TAAD e TAV-TAAD foram regulados positivamente sob condições de deformação em contraste com condições estáticas (Figura 5H,J). Esses resultados em HASMCs primários derivados de pacientes BAV-TAAD e TAV-TAAD no chip PDMS foram consistentes com os resultados da linhagem celular HASMC CRL1999, indicando que a combinação de HASMCs primários derivados do paciente e o modelo HASMC-OOC replicam as características do HASMC no TAAD, que fornece um modelo de doença in vitro BAV-TAAD e TAV-TAAD para investigação mais aprofundada dos mecanismos moleculares da doença e triagem de medicamentos.
Figura 1: Projeto esquemático do sistema HASMC-OOC. O sistema consiste em um sistema de controle de vácuo, um sistema de circulação e chips PDMS. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Procedimento de preparação do chip PDMS. O gel PDMS foi derramado em um molde de PMMA e reticulado a 70 °C por 1-2 h. Em seguida, as três placas PDMS e duas membranas PDMS foram tratadas com plasma por 5 min e unidas. Finalmente, os chips PDMS preparados foram esterilizados e uma concentração de 2 x 105 células/mL de suspensão de HASMC foi lentamente despejada no microcanal médio do chip PDMS. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os parâmetros detalhados e as propriedades mecânicas do chip PDMS. (A) Os parâmetros detalhados do chip PDMS. O tamanho da laje PDMS foi de 100 mm × 40 mm × 6 mm, e o tamanho do microcanal foi de 70 mm × 6 mm × 4 mm. (B) Os parâmetros da membrana PDMS comercial. A amplitude de alongamento calculada da membrana PDMS em diferentes pressões de vácuo para larguras de microcanais de 2 mm (C), 4 mm (D) e 6 mm (E). Os dados mostram média ± desvio padrão (DP). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Morfologia celular, orientação e alteração fenotípica das CMHHs sob condições de deformação cíclica. (A) Imagem representativa do ensaio LIVE/DEAD no dia 3 e no dia 5 após a cultura da linhagem celular HASMC (CRL1999) num chip PDMS. (B) Coloração de actina-F do CRL1999 em condições estáticas e de deformação. (C) A orientação celular do CRL1999 em condições estáticas e de deformação. Imagem representativa da coloração por imunofluorescência de SM22 (D) e CNN1 (E) na CRL1999 em condições estáticas e de deformação. (F) A intensidade relativa da coloração por imunofluorescência de SM22 e CNN1. (G) Expressão de mRNA SM22 e CNN1 em CRL1999 em condições estáticas e de deformação. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, testes t de Student bicaudais foram utilizados para comparar os dois grupos. Os dados mostram a média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Morfologia celular e alterações fenotípicas no BAV-TAAD e TAV-TAAD derivado do paciente HASMC-OOC. Imagem representativa da coloração com actina F de HASMCs primários derivados de BAV-TAAD (A) e HASMCs primários derivados de TAV-TAAD (B) sob condições estáticas e de deformação. Coloração por imunofluorescência SM22 em HASMCs primários derivados de BAV-TAAD (C) e HASMCs primários derivados de TAV-TAAD (D) sob condições estáticas e de deformação. Imagem representativa da coloração por imunofluorescência da CNN1 em HASMCs primários derivados de BAV-TAAD (E) e HASMCs primários derivados de TAV-TAAD (F) sob condições estáticas e de deformação. (G) A intensidade relativa da coloração por imunofluorescência SM22 e CNN1 em CMSAs primários derivados de BAV-TAAD. (H) Expressão de mRNA SM22 e CNN1 em HASMCs primários derivados de BAV-TAAD em condições estáticas e de deformação. (I) A intensidade relativa da coloração por imunofluorescência SM22 e CNN1 em CMHAS primários derivados de TAV-TAAD. (J) Expressão de mRNA SM22 e CNN1 em HASMCs primários derivados de TAV-TAAD em condições estáticas e de deformação. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, testes t de Student bicaudais foram utilizados para comparar os dois grupos. Os dados mostram a média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 suplementar: Instrução esquemática da preparação do equipamento. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Com o rápido desenvolvimento da tecnologia microfluídica, modelos OOC que podem replicar a função biológica e a estrutura de um ou mais órgãos in vitro surgiram nos últimos anos para aplicações em biologia, medicina e farmacologia15. A OCO pode simular funções-chave do microambiente fisiológico humano, essenciais para explorar os mecanismos da doença e promover a tradução pré-clínica de medicamentos 8,16. Embora o OOC ainda esteja nos estágios iniciais e mais informações sejam necessárias para otimizar o projeto do OOC, muito progresso foi feito nos últimos anos17,18. Ao contrário de outros modelos de cultura celular tridimensional, o OOC pode imitar os parâmetros biomecânicos do corpo humano que são essenciais para o desenvolvimento de tecidos e manutenção da função do órgão. Órgãos e tecidos do sistema cardiovascular são constantemente submetidos a cisalhamento induzido por fluxo de fluido e tensão cíclica in vivo. Portanto, os experimentos celulares in vitro do sistema cardiovascular precisam ser realizados em uma plataforma experimental que forneça tais parâmetros biomecânicos para obter resultados experimentais realistas comparáveis aos obtidos a partir de estudos in vivo.
Neste estudo, estabelecemos um HASMC-OOC que pode controlar com precisão os parâmetros da cepa biomecânica a que os HASMCs são submetidos. É possível controlar a velocidade do fluido e o cisalhamento do fluido a que as células estão sujeitas, bem como controlar com precisão a amplitude, a frequência e o ritmo de diferentes padrões de deformação cíclica. Dos muitos materiais que têm sido utilizados no campo da OCO, o PDMS é um dos mais amplamente adotados 19,20,21. O PDMS é transparente, flexível, biocompatível e respirável, e essas propriedades contribuem para seu amplo uso no campo de chips microfluídicos19. As mudanças de pressão aplicadas podem deformar o PDMS para atingir a força mecânica de contração e relaxamento, e a permeabilidade do PDMS garante que o ambiente de cultura celular no chip possa ser consistente com as condições de incubação de 5% de CO2 a 37 °C na incubadora. Portanto, o PDMS não apenas fornece força mecânica controlada às células, mas também fornece um ambiente de cultura adequado para o crescimento celular normal. Nossos resultados experimentais mostram que a morfologia e a atividade das células cultivadas no chip PDMS são consistentes com as condições de cultura 2D, indicando que o PDMS é biocompatível.
Em condições fisiológicas biomiméticas in vivo , as CMHS na parede aórtica são submetidas à deformação cíclica de aproximadamente 9%22. Em condições patológicas, como hipertensão, dilatação da aorta e aneurisma da aorta, as CMHS são submetidas a tensão cíclica maior que 16%23. Caracterizamos as propriedades de tração do chip PDMS, e os resultados experimentais mostram que uma pressão de vácuo de 10 kPa induziu 7,18 ± deformação de 0,44% e 15 kPa induziu 17,28 ± deformação de 0,91%. Além disso, a frequência da tensão e da tensão de cisalhamento do fluido pode ser controlada por este sistema de chip PDMS. Usando HASMCs primários derivados de pacientes BAV-TAAD e TAV-TAAD, os mecanismos moleculares e a triagem medicamentosa dessas doenças da aorta podem ser conduzidos usando este modelo in vitro HASMC-OOC, que pode replicar a patogênese da doença de diferentes doenças da aorta. Utilizando esse sistema, estabelecemos um modelo de doença para estudar a patogênese do BAV-TAAD e revelamos que o ativador de fusão mitocondrial poderia resgatar parcialmente a disfunção mitocondrial em células doentes24.
O HASMC-OOC foi projetado com base na inspiração e referência do lung-on-a-chip do trabalho de Ingber9. Seu dispositivo replicava movimentos respiratórios fisiológicos dos alvéolos no pulmão, e o chip consistia em três camadas: canais médios superiores e inferiores, uma membrana PDMS porosa e duas câmaras de vácuo laterais. As câmaras de vácuo laterais só podem ser feitas em laboratórios especializados com equipamentos microfluídicos avançados. Para permitir a montagem em condições laboratoriais mais gerais, colocamos as câmaras de vácuo na parte superior e inferior do chip. Ambas as abordagens de alongamento têm funções semelhantes, de modo que a estrutura do chip pode ser escolhida de acordo com as condições laboratoriais e as necessidades de pesquisa para queselecionado. Além disso, para estabelecer estruturalmente a estrutura tubular da aorta humana e obter mais amostras biológicas das células para a realização de análises biológicas complexas e ensaios experimentais, estabelecemos um chip PDMS de cinco camadas com canais maiores, que consistia em um canal médio médio, duas membranas PDMS e câmaras de vácuo superior e inferior. Duas membranas PDMS e os grandes canais do chip PDMS aumentaram a área de cultura celular em até 8,4 cm2, fornecendo amostras suficientes para análise de proteínas. As plataformas relatadas anteriormente concentraram-se principalmente na investigação de doenças arteriais menores, como artéria cerebral, vaso periférico ou outras doenças arteriais25,26. A aorta é um grande vaso com um diâmetro de 25-35 mm, e a túnica média da aorta é composta principalmente de células musculares lisas sujeitas a alta tensão de tração. A patologia da aortopatia está associada ao remodelamento da parede aórtica, apoptose das células musculares lisas e comutação fenotípica, todos os quais podem ser regulados pelo estresse mecânico. Assim, os CMASases derivados do paciente e a deformação de tração são componentes essenciais para o sucesso do CMAS-OOC. No entanto, existem algumas limitações para este estudo. O HASMC-OOC não utilizou células vasculares cocultivadas, incluindo HASMCs, células endoteliais aórticas e fibroblastos, que podem simular melhor o microambiente in vivo da aorta humana e podem ser usados para estudar a interação entre essas células. Embora os HASMCs experimentem tensão rítmica, as células ainda são cultivadas em uma membrana PDMS plana que não consegue imitar a matriz extracelular. Em estudos futuros, superaremos essas limitações combinando chips microfluídicos com tecnologia de bioimpressão 3D.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem que este trabalho foi apoiado por doações da Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (20ZR1411700), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81771971) e do Programa de Vela de Xangai (22YF1406600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
