Summary
Burada, insan aort duvarındaki düz kas hücrelerinin in vivo biyomekanik suşunu çoğaltmak için bir insan aort düz kas hücresi organı-on-a-chip modeli geliştirdik.
Abstract
İnsan torasik aort anevrizması ve diseksiyonu (TAAD) çalışmasında geleneksel iki boyutlu hücre kültürü teknikleri ve hayvan modelleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, insan TAAD bazen hayvan modelleri ile karakterize edilemez. Klinik insan çalışmaları ile hayvan deneyleri arasında, terapötik ilaçların keşfini engelleyebilecek belirgin bir tür boşluğu vardır. Buna karşılık, geleneksel hücre kültürü modeli in vivo biyomekanik uyaranları simüle edemez. Bu amaçla, mikrofabrikasyon ve mikroakışkan teknikler son yıllarda büyük ölçüde gelişmiş ve biyomekanik mikro çevreyi kopyalayan çip üzerinde organoidler modelleri oluşturmak için yeni teknikler sağlamıştır. Bu çalışmada, TAAD'da hayati bir rol oynayan insan aort düz kas hücrelerinin (HASMC'ler) yaşadığı siklik suşun genliği ve sıklığı da dahil olmak üzere aort biyomekaniğinin patofizyolojik parametrelerini simüle etmek için bir insan aort düz kas hücresi organı-on-a-chip (HASMC-OOC) modeli geliştirilmiştir. Bu modelde, HASMC'lerin morfolojisi şekil olarak uzamış, gerinim yönüne dik olarak hizalanmış ve gerinim koşulları altında statik konvansiyonel koşullara göre daha kasılı bir fenotip sunmuştur. Bu, doğal insan aort duvarlarındaki hücre oryantasyonu ve fenotipi ile tutarlıydı. Ek olarak, biküspid aort kapağı ile ilişkili TAAD (BAV-TAAD) ve triküspid aort kapağı ile ilişkili TAAD (TAV-TAAD) hasta kaynaklı primer HASMC'leri kullanarak, TAAD'da HASMC özelliklerini kopyalayan BAV-TAAD ve TAV-TAAD hastalık modellerini kurduk. HASMC-OOC modeli, TAAD'ın patogenezini daha fazla araştırmak ve terapötik hedefleri keşfetmek için hayvan modellerini tamamlayan yeni bir in vitro platform sunmaktadır.
Introduction
Torasik aort anevrizması ve diseksiyonu (TAAD), yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkili olan aort duvarının lokalize dilatasyonu veya delaminasyonudur1. İnsan aort düz kas hücreleri (HASMC'ler) TAAD'ın patogenezinde hayati bir rol oynamaktadır. HASMC'ler ölümcül olarak farklılaşmış hücreler değildir ve HASMC'ler yüksek plastisiteyi koruyarak farklı uyaranlara yanıt olarak fenotipleri değiştirmelerine izin verir2. HASMC'ler esas olarak in vivo ritmik gerilme suşuna maruz kalırlar ve bu düz kas morfolojik değişikliklerini, farklılaşmasını ve fizyolojik fonksiyonlarını düzenleyen anahtar faktörlerden biridir 3,4. Bu nedenle, HASMC'lerin çalışmasında siklik suşun rolü göz ardı edilemez. Bununla birlikte, geleneksel 2D hücre kültürleri, HASMC'lerin in vivo olarak yaşadığı siklik suşun biyomekanik stimülasyonunu çoğaltamaz. Ek olarak, bir hayvan TAAD modelinin yapımı, biküspid aort kapağı (BAV) ile ilişkili TAAD gibi bazı TAAD türleri için uygun değildir. Dahası, klinik insan çalışmaları ile hayvan deneyleri arasındaki tür farkı göz ardı edilemez. Klinik pratikte farmasötik translasyonu engellemektedir. Bu nedenle, aort hastalıklarının araştırılmasında in vivo biyomekanik ortamı simüle etmek için daha karmaşık ve fizyolojik sistemlere acil bir ihtiyaç vardır.
Biyomedikal araştırma ve ilaç geliştirmede kullanılan hayvan deneyleri maliyetli, zaman alıcı ve etik olarak sorgulanabilir. Ek olarak, hayvan çalışmalarından elde edilen sonuçlar sıklıkla insan klinik çalışmalarında elde edilen sonuçları tahmin edememektedir 5,6. İnsan preklinik modellerinin eksikliği ve klinik çalışmalardaki yüksek başarısızlık oranı, klinik için az sayıda etkili ilaçla sonuçlanmış ve bu da sağlık bakım maliyetlerini artırmıştır7. Bu nedenle, hayvan modellerini tamamlamak için başka deneysel modeller bulmak acildir. Mikrofabrikasyon ve mikroakışkan teknikler son yıllarda büyük ölçüde gelişmiştir ve geleneksel 2D hücre kültürü tekniklerinin dezavantajlarını gideren ve fizyolojik çalışmalar ve ilaç geliştirme için daha gerçekçi, düşük maliyetli ve verimli bir in vitro model oluşturan çip üzerinde organoidler modelleri oluşturmak için yeni teknikler sağlamıştır. Mikroakışkan cihazlar kullanılarak, bir doku veya organın temel işlevlerini çoğaltmak için farklı uyaranlara sahip mikrometre büyüklüğündeki odalarda canlı hücreleri kültürlemek için çip üzerindeki organlar kurulur. Sistem, tek veya çoklu mikroakışkan mikrokanallardan oluşur; ya bir doku tipinin işlevlerini çoğaltan perfüze edilmiş bir odada kültürlenmiş bir tür hücre ya da farklı dokular arasındaki arayüzleri yeniden oluşturmak için gözenekli membranlar üzerinde kültürlenmiş farklı hücre tipleri. Hasta kaynaklı hücrelerle birleştirilen mikroakışkan bazlı organoidler, fare ve insan hastalığı modelleri arasındaki büyük tür farkını köprüleme ve hastalık mekanizması araştırması ve ilaç keşfi için geleneksel 2D hücre kültürünün dezavantajlarının üstesinden gelme konusunda benzersiz bir avantaja sahiptir. Son birkaç yılda mikroakışkanların hızlı bir şekilde gelişmesiyle birlikte, araştırmacılar kompleks in vivo biyolojik parametreleri kopyalayan in vitro çip üzerinde organ (OOC) modellerinin yararlılığını fark etmişlerdir8. Bu mikroakışkan organoidler, siklik gerinim, kesme gerilmesi ve sıvı basıncı gibi in vitro biyomekanik ortamları simüle ederek üç boyutlu (3B) bir hücre kültürü ortamı sağlar. Bugüne kadar, akciğer9, böbrek 10, karaciğer 11, bağırsak12 ve kalp13 gibi organlarda biyomekanik uyaranları simüle etmek için çeşitli OOC modelleri kurulmuştur, ancak bunlar insan aort hastalığının incelenmesine yaygın olarak uygulanmamıştır.
Bu çalışmada, TAAD hasta kaynaklı primer HASMC'lere uygulanan biyomimetik mekanik kuvvetleri ve ritimleri kontrol edebilen bir insan aort düz kas hücre organı-on-a-chip (HASMC-OOC) modeli sunulmuştur. Çip, kanallarla kazınmış üç katmanlı kalın polidimetilsiloksan (PDMS) plakalarından ve ticarileştirilmiş iki yüksek esnekliğe sahip PDMS membranından oluşur. HASMC'ler PDMS membranları üzerinde kültürlenir. Çipin ortasındaki kanal, hücre kültürü için bir kültür ortamı ile doldurulur. Çipin üst ve alt kanalları, PDMS membranlarının mekanik çekme geriniminin ritmini ve frekansını kontrol edebilen bir vakum basıncı besleme sistemine bağlanır. HASMC'lerin yaşadığı ritmik gerinim, HASMC-OOC'de simüle edilebilir ve geleneksel 2D kültür sistemleriyle işlevsel olarak elde edilemeyen doku veya organın biyomekanik mikro ortamını çoğaltır. Yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görüntüleme ve biyomekanik mikroçevre avantajı ile canlı hücrelerin biyokimyasal, genetik ve metabolik aktiviteleri doku gelişimi, organ fizyolojisi, hastalık etiyolojisi, moleküler mekanizmalar ve biyobelirteç tanımlama, kardiyovasküler hastalık ve aort hastalığı açısından incelenebilir. Dokuya özgü ve hasta hücreleri ile birleştirilen bu sistem, ilaç taraması, kişiselleştirilmiş tıp ve toksisite testi için kullanılabilir. Bu HASMC-OOC modeli, aort hastalığının patogenezini incelemek için yeni bir in vitro platform sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan aort örnekleri, Zhongshan Hastanesi, Fudan Üniversitesi Etik Komitesi'nin onayı altında birincil HASMC izolasyonu için kullanılmıştır (NO. B2020-158). Fudan Üniversitesi, Zhongshan Hastanesi'nde asendan aort cerrahisi geçiren hastalardan aort örnekleri toplandı. Katılım öncesinde tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Birincil insan aort düz kas hücresi izolasyonu
- Yükselen aortun sağ lateral bölgesini steril PBS, 1x-2x ile yıkayın.
- Dokunun intima ve adventitia katmanlarını iki oftalmik forseps ile çıkarın ve hücreleri toplamak için medya tabakasını koruyun.
- Medya tabakasını 10 cm'lik bir kültür kabına yerleştirin ve makasla küçük parçalara (2-3 mm) kesin. % 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren 5 mL düz kas hücre kültürü ortamı (SMCM) ekleyin.
- Küçük dokuyu steril bir damlalıkla kültür şişesine taşıyın ve dokuyu eşit şekilde yayın. Kültür ortamını mümkün olduğunca atın, ardından şişeyi baş aşağı çevirin.
- Ters çevrilmiş kültür şişesine 2 mL SMCM ekleyin ve 1-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübatöre (% 5 CO 2) yerleştirin, ardından yavaşça sağa doğru çevirin ve2 mL SMCM daha ekleyin.
- 5-7 günlük inkübasyondan sonra, SMCM'yi 4 mL taze SMCM ile değiştirin. Genel olarak, sporadik düz kas hücreleri yaklaşık 2 hafta içinde dışarı çıkar.
- SMCM'yi yavaşça atın ve ortamı değiştirirken yavaşça ekleyin. Bir mikroskop istasyonuna giderken kültür şişesini yavaşça taşıyın; aksi takdirde, dokular yüzer ve hücreler yavaşça büyür.
- Hücreler yaklaşık% 80 akıcılığa ulaştığında, 2 mL PBS ile yıkayın, 2 mL% 0.25 tripsin ile sindirin ve bunları 4 mL taze SMCM ile iki yeni kültür şişesine bölün.
- Düz kas hücreleri için dört farklı spesifik belirtecin immünofloresan analizi yoluyla hücreleri tanımlayın (CNN1, SM22)14.
2. PDMS çipinin hazırlanması
- PDMS'yi polimerize etmek için, baza (A bileşeni) A: B = 10: 1 w / w ağırlık oranında kürleme maddesi (B bileşeni) ekleyin ve kompleksi 5 dakika boyunca tamamen karıştırın; hacim çalışmanın ihtiyacına bağlıdır.
- Hazırlanan PDMS jelini 30-60 dakika boyunca bir vakum ekstraksiyon tankına yerleştirin ve basıncı -0,8 mPa'nın altında tutun.
NOT: Yüksek basınç, PDMS jeli içindeki küçük kabarcıkların yetersiz ekstraksiyonuna yol açacak ve bu da talaş üretiminin bir sonraki adımını etkileyecektir. - Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımını kullanarak, kalıbı 100 mm × 40 mm × 8 mm dış çerçeve yapısı ve 70 mm × 6 mm × 4 mm kanal ile tasarlayın.
- Özel, yüksek hassasiyetli bir bilgisayar sayısal kontrol gravür makinesi kullanarak üç katmanın kalıplarını yapın. Polimetil metakrilat (PMMA) plakaları kullanarak kalıpların ve mikro kanalların çerçevesini oyun ve ardından bunları başka bir PMMA plakasına yapıştırın.
- Hazırlanan PDMS jelini 100 mm × 40 mm × 6 mm dış çerçeveye ve 70 mm × 6 mm × 4 mm kanala sahip bir kalıba dökün ve ardından 1-2 saat boyunca 70 °C'de çapraz bağlayın.
- Çapraz bağlı PDMS plakalarını kalıptan çıkarın ve ticarileştirilmiş PDMS membranlarını 100 mm × 40 mm kesitler halinde kesin.
- PDMS yüzey aktivasyonu için hazırlanan üç PDMS levhasını ve iki PDMS membranını 5 dakika boyunca oksijen plazma ile tedavi edin. Aşağıdaki özel ayarları uygulayın: proses gazı olarak oda havası; basınç -100 kPa'ya ayarlanmış; akım 180--200 Ma olarak ayarlanmış; voltaj 200 V'a ayarlanmış; işlem süresi 5 dakikaya kadardır.
- PDMS çipi üzerindeki hava ve orta mikro kanalların giriş ve çıkışını yapmak için 1 mm'lik bir delik delici kullanarak üç PDMS plakası üzerindeki delikleri delin.
- Üç PDMS levhayı ve iki PDMS membranını sırayla birbirine bağlayın: hava kanalı PDMS levha (üst katman) - PDMS membran - orta kanallı PDMS levha (orta katman) - PDMS membran - hava kanalı PDMS levha (alt katman). Hava mikro kanallarını orta mikrokanallarla tamamen üst üste bindirmek için bu adımı stereoskopik mikroskop altında 4x'te gerçekleştirin.
- Monte edilen PDMS çipini 1 saat boyunca 70 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Birkaç adet 1 mm iç çap ve 3 cm uzunluğunda lateks hortum hazırlayın. Hazırlanan hortumun bir ucuna 1 mm dış çap ve 1 cm uzunluğunda paslanmaz çelik bir iğne yerleştirin ve ardından PDMS çipinin havasına ve orta mikro kanallarına bağlı tüpü oluşturmak için hortumun diğer ucuna bir Luer yerleştirin.
- Hazırlanan tüpleri PDMS çipi üzerindeki hava ve orta mikro kanalların çıkışlarına ve girişlerine yerleştirin.
3. PDMS çip yüzey işleme ve sterilizasyon
- 2 mL'lik bir şırınga kullanarak PDMS çipinin orta mikro kanalına 2 mL 80 mg/mL fare kolajeni enjekte edin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Kuluçkadan sonra, kollajeni kanaldan çıkarın ve 2 mL'lik bir şırınga ile hatırlayın. Kollajen kaplı PDMS yongalarını gece boyunca 60 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- PDMS yongalarını UV sterilizatörüne 1 saatten fazla yerleştirin. Sterilize edilmiş PDMS çiplerini, hücre deneyine hazırlık olarak ultra temiz bir tezgaha yerleştirin.
4. PDMS çipi üzerinde hücre tohumlama ve hücre germe işlemi
- Kültür 4 x 1037 ° C'de% 5 CO2 inkübatöründe% 2 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren düz kas hücresi ortamı (SMCM) kullanan hastalardan 5 primer insan düz kas hücresi hücresi hücresi (HASMC'ler).
- HASMC yoğunluğu% 80'e ulaştığında, SMCM'yi atın ve hücreleri 2 mL PBS ile yıkayın.
- Hücreleri 2 dakika boyunca 1 mL% 0.25 tripsin kullanarak ve 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj kullanarak sindirin. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 1 mL taze SMCM'de yeniden askıya alın. Hücreleri 10 cm'lik bir kültür kabı üzerinde kültürlemek için 8 mL SMCM kullanın.
- Bir sitometre kullanarak hücre sayısını hesaplayın ve hücreleri 2 x 105 hücre / mL'lik son konsantrasyonda kullanın.
- Kollajen kaplı ve sterilize edilmiş PDMS çip ortamı mikro kanalına yavaşça 2 mL PBS dökün ve daha sonra 2 mL'lik bir şırınga kullanarak atın.
- 2 mL'lik bir şırınga kullanarak PDMS çipinin orta mikrokanalına toplam 2 mL 2 x 105 hücre/mL HASMC süspansiyonunu yavaşça dökün. Ardından, PDMS yongasının giriş ve çıkışındaki Luer'i kapatın. PDMS çipini 1 gün boyunca 37 °C'de bir inkübatöre (%5 CO2) yerleştirin.
- Hücreler PDMS çipindeki PDMS membranına bağlandıktan sonra, yaklaşık 24 saat sonra, PDMS çipi üzerindeki hava mikrokanalının çıkışını vakum kontrol sistemine bağlayın. Hücre bağlandığında, mikroskop altında, asılı yuvarlak hücrelerle tezat oluşturan uzun, normal bir hücresel form görülebilir.
- Solenoid valfi ve vakum pompasını açın. Vakum regülatörünü açın ve basınç seviyesini 7,18 ±% 0,44 gerinim için 10 kPa'ya ve 17,28 ±% 0,91 gerinim için 15 kPa'ya ayarlayın.
- Kontrol sisteminin parametreleri ayarlandıktan sonra, PDMS yongalarını 37 ° C'de bir inkübatöre (% 5 CO2) yerleştirin ve 24 saat boyunca gerin.
5. Mekanik kontrol sisteminin hazırlanması
- Birkaç solenoid valf, vakum filtreleri, vakum regülatörleri, bir vakum pompası, bir peristaltik pompa ve solenoid valfi kontrol eden programlanabilir bir mantık kontrolörü (PLC) hazırlayın.
- PLC kontrolörünü programlayın ve açma/kapama zaman aralığını 1 Hz'e ayarlayın.
- Vakum pompasının girişini vakum filtrelerine bağlayın ve ardından vakum filtrelerinin çıkışını vakum regülatörlerine bağlayın. Vakum regülatörlerinin çıkışını solenoid valflere bağlayın ve son olarak, solenoid valflerin çıkışını PDMS yongalarının hava mikrokanallarının çıkışlarına bağlayın.
- Kültür ortamı değişimi ve ilaç kullanımı için peristaltik pompanın çıkışını PDMS çipinin orta mikrokanalının girişine ve peristaltik pompanın girişini orta mikrokanal PDMS çipinin çıkışına bağlayın.
- Gerinimin genliğini regülatör tarafından ve gerinim frekansını mikrodenetleyici ile ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HASMC-OOC modeli, bir vakum kontrol sistemi, bir dolaşım sistemi ve PDMS yongalarından ve HASMC-OOC modelinin şematik tasarımından oluşur (Şekil 1). Vakum kontrol sistemi bir vakum pompası, solenoid valfler ve bir PLC kontrolöründen oluşur. Dolaşım sistemi olarak hareket etmek için, hücre kültürü ortamını yenilemek ve ilaç eklemek için peristaltik bir pompa kullanıldı. PDMS çipi, hücre büyümesi için iki vakum odasından ve SMCM ile doldurulmuş bir orta odadan oluşuyordu. Talaş yapısının tasarımına göre PMMA kalıbı hazırlanmış, üç PDMS levha ise kalıplara dökülerek ve 2 saat boyunca 70 °C'de çapraz bağlanarak hazırlanmıştır. Plazma ile tedaviden sonra, üç PDMS levhası ve iki PDMS membranı birbirine bağlandı (Şekil 2). PDMS yongaları hazırlandığında, HASMC'ler çipteki PDMS membranı üzerinde kültürlendi ve PDMS çipleri vakum kontrol sistemine ve dolaşım sistemine bağlandı. Tüm sistemin şeması Ek Şekil 1'de gösterilmiştir. PDMS çip parametreleri Şekil 3A'da, PDMS membranının mekanik özellikleri ise Şekil 3B'de gösterilmiştir. PDMS membranının çekme gerinimlerini ölçmek için, PDMS membranlarının gerçek zamanlı deformasyonlarını, mikroakışkan modelin kesitsel görünümünden, 0 kPa, 10 kPa, 15 kPa, 20 kPa, 25 kPa ve 30 kPa vakum basınçlarıyla yakaladık. Ayrıca, PDMS membranının gerinim büyüklüğünü 2 mm, 4 mm ve 6 mm'lik farklı kültürleme kanalı genişliklerinde değerlendirmek için uzunluktaki değişiklikleri de ölçtük (Şekil 3C-E). PDMS çipinde 6 mm genişliğinde mikro kanallar kullanılmıştır. Sonuçlar, 10 kPa'lık bir vakum basıncının 7.18 ±% 0.44 gerinimine ve 15 kPa'nın% 0.91 gerinimden 17.28 ± indüklediğini göstermiştir (Şekil 3E).
PDMS çipindeki HASMC hücre hattının (CRL1999) hücre canlılığını doğrulamak için, hücreler kültürlendikten sonra 3. ve 5. günlerde bir LIVE / DEAD testi yapıldı. Sonuçlar, hücre canlılığının 3. gün ve 5. günde% 90'dan yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 4A). PDMS çipinde CRL1999'un sitoiskelet (F-aktin) boyaması normal hücre morfolojisi gösterdi ve hücreler 24 saat gerildikten sonra gerilmeye dik olarak hizalandı (Şekil 4B-C). Kasılma belirteçleri SM22 ve CNN1'in immünofloresan boyaması, 24 saatlik ritmik gerilmeden sonra HASMC-OOC kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 4D-E). Başlamak için, 2 mL PBS yavaşça kanala döküldü ve 2 mL'lik bir şırınga ile atıldı. Daha sonra, kanala 2 mL% 4 (v / v) paraformaldehit döküldü ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edildi. Bundan sonra, 2 mL% 0.2 (v / v) Triton X-100, 2 mL'lik bir şırınga ile kanala döküldü ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edildi. Bunu 2 mL PBS'nin yavaşça kanala dökülmesi ve hücreleri yıkadıktan sonra 2 mL'lik bir şırınga ile atılması izledi. Daha sonra, 2 mL% 5 (w / v) sığır serum albümini yavaşça kanala döküldü ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edildi. Daha sonra, 1 mL SM22 veya CNN1 antikoru yavaşça kanala döküldü ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edildi. Kuluçkadan sonra, 1 mL keçi anti-tavşan sekonder antikoru yavaşça kanala döküldü ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edildi. Son olarak, 1 mL DAPI çözeltisi yavaşça kanala döküldü ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edildi. Sonuçlar, SM22 ve CNN1'in gerinim koşulları altındaki floresan yoğunluğunun statik koşullar altındakinden daha yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 4F). Statik koşullarla karşılaştırıldığında, HASMC'lerdeki SM22 ve CNN1 genleri gerinim koşullarında yukarı regüle edildi (Şekil 4G). Bu veriler, CRL1999'un gerinim yönüne dik olarak hizalandığını ve kontraktil bir fenotipin gerinim koşulları altında, statik koşullar altında geleneksel hücre kültürlenmesine göre daha belirgin olduğunu göstermiştir.
Biküspid aort kapağı ile ilişkili TAAD (BAV-TAAD) ve triküspid aort kapak ile ilişkili TAAD (TAV-TAAD) hasta kaynaklı primer HASMC'leri kullanarak BAV-TAAD ve TAV-TAAD hastalık modellerini oluşturduk. BAV-TAAD ve TAV-TAAD hasta kaynaklı primer HASMC'lerin F-aktin boyamasının sonuçları normal hücre morfolojisini ve hücrelerin 24 saat gerildikten sonra gerinim yönüne dik olarak hizalandığını göstermiştir (Şekil 5A-B). İmmünofloresan boyama, BAV-TAAD ve TAV-TAAD hasta kaynaklı primer HASMC'lerde SM22 ve CNN1 ekspresyonunun gerinim koşullarında statik koşullara göre daha yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 5C-G,I). BAV-TAAD ve TAV-TAAD hasta kaynaklı primer HASMC'lerde SM22 ve CNN1'in gen ekspresyon düzeyleri, statik koşulların aksine gerinim koşulları altında yukarı regüle edildi (Şekil 5H, J). PDMS çipindeki BAV-TAAD ve TAV-TAAD hasta kaynaklı primer HASMC'lerdeki bu sonuçlar, HASMC hücre hattı CRL1999'dan elde edilen sonuçlarla tutarlıydı, bu da hasta kaynaklı birincil HASMC'lerin ve HASMC-OOC modelinin kombinasyonunun, hastalığın moleküler mekanizmalarının ve ilaç taramasının daha ileri araştırılması için bir BAV-TAAD ve TAV-TAAD in vitro hastalık modeli sağlayan TAAD'daki HASMC özelliklerini çoğalttığını göstermektedir.
Resim 1: HASMC-OOC sisteminin şematik tasarımı. Sistem bir vakum kontrol sistemi, bir dolaşım sistemi ve PDMS çiplerinden oluşur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PDMS çip hazırlama prosedürü. PDMS jeli bir PMMA kalıbına döküldü ve 1-2 saat boyunca 70 ° C'de çapraz bağlandı. Daha sonra, üç PDMS levhası ve iki PDMS membranı 5 dakika boyunca plazma ile muamele edildi ve birbirine bağlandı. Son olarak, hazırlanan PDMS çipleri sterilize edildi ve PDMS çipinin orta mikrokanalına yavaşça 2 x 105 hücre / mL HASMC süspansiyon konsantrasyonu döküldü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PDMS çipinin ayrıntılı parametreleri ve mekanik özellikleri. (A) PDMS çipinin ayrıntılı parametreleri. PDMS levha boyutu 100 mm × 40 mm × 6 mm ve mikrokanal boyutu 70 mm × 6 mm × 4 mm idi. (B) Ticari PDMS membranının parametreleri. PDMS membranının 2 mm (C), 4 mm (D) ve 6 mm (E) mikrokanal genişlikleri için farklı vakum basınçlarında hesaplanan gerilme genliği. Veriler ortalama ± standart sapmayı (SD) göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Siklik gerinim koşulları altında HASMC'lerin hücre morfolojisi, oryantasyonu ve fenotip değişimi. (A) Bir PDMS çipi üzerinde kültürlenen HASMC hücre hattından (CRL1999) sonraki 3. ve 5. günlerde LIVE/DEAD testinin temsili görüntüsü. (B) CRL1999'un statik ve gerinim koşulları altında F-aktin boyaması. (C) CRL1999'un statik ve gerinim koşulları altında hücre oryantasyonu. CRL1999'da statik ve gerinim koşulları altında SM22 (D) ve CNN1 (E)'nin immünofloresan boyanmasının temsili görüntüsü. (F) SM22 ve CNN1'in immünofloresan boyamasının nispi yoğunluğu. (G) Statik ve gerinim koşulları altında CRL1999'da SM22 ve CNN1 mRNA ekspresyonu. n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, iki kuyruklu Student t-testleri iki grubu karşılaştırmak için kullanıldı. Veriler ortalama ± SD'yi göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: BAV-TAAD ve TAV-TAAD hasta kaynaklı HASMC-OOC'de hücre morfolojisi ve fenotipik değişiklikler. Statik ve gerinim koşulları altında BAV-TAAD (A) türevi primer HASMC'lerin ve TAV-TAAD (B) türevi primer HASMC'lerin F-aktin boyamasının temsili görüntüsü. Statik ve gerinim koşulları altında BAV-TAAD (C) türevi primer HASMC'lerde ve TAV-TAAD (D) türevi primer HASMC'lerde SM22 immünofloresan boyama. Statik ve gerinim koşulları altında BAV-TAAD (E) türevi primer HASMC'lerde ve TAV-TAAD (F) türevi primer HASMC'lerde CNN1'in immünofloresan boyanmasının temsili görüntüsü. (G) BAV-TAAD türevi primer HASMC'lerde SM22 ve CNN1 immünofloresan boyamasının göreceli yoğunluğu. (H) Statik ve gerinim koşulları altında BAV-TAAD türevi primer HASMC'lerde SM22 ve CNN1 mRNA ekspresyonu. (I) TAV-TAAD kaynaklı primer HASMC'lerde SM22 ve CNN1 immünofloresan boyamasının bağıl yoğunluğu. (J) Statik ve gerinim koşulları altında TAV-TAAD türevi primer HASMC'lerde SM22 ve CNN1 mRNA ekspresyonu. n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, iki kuyruklu Student t-testleri iki grubu karşılaştırmak için kullanıldı. Veriler ortalama ± SD'yi göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Ekipman hazırlığının şematik talimatı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroakışkan teknolojisinin hızla gelişmesiyle birlikte, biyoloji, tıp ve farmakoloji uygulamaları için son yıllarda bir veya daha fazla organın biyolojik fonksiyonunu ve yapısını in vitro olarak kopyalayabilen OOC modelleri ortaya çıkmıştır15. OOC, hastalık mekanizmalarını araştırmak ve klinik öncesi ilaç translasyonunu teşvik etmek için gerekli olan insan fizyolojik mikro çevresinin temel işlevlerini simüle edebilir 8,16. OOC hala erken aşamalarda olmasına ve OOC'nin tasarımını optimize etmek için daha fazla girdiye ihtiyaç duyulmasına rağmen, son yıllarda çok ilerleme kaydedilmiştir17,18. Diğer üç boyutlu hücre kültürü modellerinin aksine, OOC, doku gelişimi ve organ fonksiyonunun sürdürülmesi için gerekli olan insan vücudunun biyomekanik parametrelerini taklit edebilir. Kardiyovasküler sistemin organları ve dokuları sürekli olarak sıvı akışına bağlı kaymaya ve in vivo siklik gerginliğe maruz kalır. Bu nedenle, kardiyovasküler sistemin in vitro hücresel deneyleri, in vivo çalışmalardan elde edilenlerle karşılaştırılabilir gerçekçi deneysel sonuçlar elde etmek için bu tür biyomekanik parametreleri sağlayan deneysel bir platformda yapılmalıdır.
Bu çalışmada, HASMC'lerin maruz kaldığı biyomekanik suşun parametrelerini tam olarak kontrol edebilen bir HASMC-OOC kurduk. Hücrelerin maruz kaldığı sıvı hızını ve sıvı makasını kontrol etmenin yanı sıra, farklı döngüsel gerinim modellerinin genliğini, frekansını ve ritmini hassas bir şekilde kontrol etmek mümkündür. OOC alanında kullanılan birçok malzemeden PDMS, en yaygın olarak benimsenen 19,20,21'den biridir. PDMS şeffaf, esnek, biyouyumlu ve nefes alabilir ve bu özellikler mikroakışkan çipler alanında geniş kullanımına katkıda bulunur19. Uygulanan basınç değişiklikleri, mekanik büzülme ve gevşeme kuvvetini elde etmek için PDMS'yi deforme edebilir ve PDMS'nin geçirgenliği, çip üzerindeki hücre kültürü ortamının, inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2'lik inkübasyon koşullarıyla tutarlı olmasını sağlar. Bu nedenle, PDMS sadece hücrelere kontrollü mekanik kuvvet sağlamakla kalmaz, aynı zamanda normal hücre büyümesine uygun bir kültür ortamı sağlar. Deneysel sonuçlarımız, PDMS çipinde kültürlenen hücrelerin morfolojisinin ve aktivitesinin, PDMS'nin biyouyumlu olduğunu gösteren 2D kültür koşullarıyla tutarlı olduğunu göstermektedir.
Biyomimetik in vivo fizyolojik koşullar altında, aort duvarındaki HASMC'ler yaklaşık% 9'luk siklik suşa maruz kalır22. Hipertansiyon, aort dilatasyonu ve aort anevrizması gibi patolojik durumlarda, HASMC'ler %16'dan daha büyük siklik suşa maruz kalır23. PDMS çipinin çekme özelliklerini karakterize ettik ve deneysel sonuçlar, 10 kPa'lık bir vakum basıncının 7.18 ±% 0.44 gerinim ve 15 kPa'nın 17.28 ±% 0.91 gerinim indüklediğini göstermiştir. Ek olarak, gerinim ve sıvı kayma gerilme frekansı bu PDMS çip sistemi tarafından kontrol edilebilir. BAV-TAAD ve TAV-TAAD hasta kaynaklı primer HASMC'ler kullanılarak, bu aort hastalıklarının moleküler mekanizmaları ve ilaç taraması, farklı aort hastalıklarının hastalık patogenezini kopyalayabilen bu HASMC-OOC in vitro modeli kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu sistemi kullanarak, BAV-TAAD'ın patogenezini incelemek için bir hastalık modeli oluşturduk ve mitokondriyal füzyon aktivatörünün hastalıklı hücrelerdeki mitokondriyal disfonksiyonu kısmen kurtarabileceğini ortaya koyduk24.
HASMC-OOC, Ingber'in9 çalışmasından çip üzerinde akciğerin ilham ve referansına dayanarak tasarlanmıştır. Cihazları, alveollerin akciğerdeki fizyolojik solunum hareketlerini kopyaladı ve çip üç katmandan oluşuyordu: üst ve alt orta kanallar, gözenekli bir PDMS membranı ve iki yan vakum odası. Yan vakum odaları sadece gelişmiş mikroakışkan ekipmanlara sahip özel laboratuvarlarda yapılabilir. Daha genel laboratuvar koşullarında montajı sağlamak için, vakum odalarını talaşın üstüne ve altına yerleştirdik. Her iki germe yaklaşımı da benzer işlevlere sahiptir, bu nedenle talaş yapısı laboratuvar koşullarına ve araştırma ihtiyaçlarına göre seçilebilir. Ek olarak, insan aortunun boru şeklindeki yapısını yapısal olarak oluşturmak ve daha karmaşık biyolojik analizler ve deneysel analizler yapmak için hücrelerden daha fazla biyolojik örnek elde etmek için, orta orta kanal, iki PDMS zarı ve üst ve alt vakum odalarından oluşan daha büyük kanallara sahip beş katmanlı bir PDMS çipi kurduk. İki PDMS membranı ve PDMS çipinin geniş kanalları, hücre kültürü alanını 8,4cm2'ye kadar artırarak protein analizi için yeterli numune sağladı. Daha önce bildirilen platformlar esas olarak serebral arter, periferik damar veya diğer arteriyel hastalıklar gibi küçük arter hastalıklarının araştırılmasına odaklanmıştır25,26. Aort, 25-35 mm çapında büyük bir damardır ve aortun tunika ortamı esas olarak yüksek gerilme gerilmesine maruz kalan düz kas hücrelerinden oluşur. Aortopatinin patolojisi, hepsi mekanik stres ile düzenlenebilen aort duvarının yeniden şekillendirilmesi, düz kas hücresi apoptozu ve fenotipik anahtarlama ile ilişkilidir. Bu nedenle, hasta kaynaklı HASMC'ler ve gerilme suşu, HASMC-OOC'nin başarısı için gerekli bileşenlerdir. Bununla birlikte, bu çalışmanın bazı sınırlamaları vardır. HASMC-OOC, insan aortunun in vivo mikro ortamını daha iyi simüle edebilen ve bu hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılabilecek HASMC'ler, aort endotel hücreleri ve fibroblastlar dahil olmak üzere kokültürlenmiş vasküler hücreleri kullanmamıştır. HASMC'ler ritmik gerginlik yaşasalar da, hücreler hala hücre dışı matrisi taklit edemeyen düz bir PDMS membranı üzerinde kültürlenir. Gelecekteki çalışmalarda, mikroakışkan çipleri 3D biyobaskı teknolojisi ile birleştirerek bu sınırlamaların üstesinden geleceğiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, bu çalışmanın Şanghay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (20ZR1411700), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81771971) ve Şanghay Yelken Programı (22YF1406600) tarafından desteklendiğini kabul etmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
