عزل وتوصيف وتطبيق علاجي للحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المستزرعة
Summary
يصف هذا البروتوكول الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية التمثيلية (exosomes و microvesicles) من MSCs البشرية المستزرعة. يتم شرح المزيد من التطبيقات لهذه المركبات الكهربائية أيضا في هذه المقالة.
Abstract
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جسيمات نانوية غشائية غير متجانسة تطلقها معظم أنواع الخلايا ، ويتم التعرف عليها بشكل متزايد كمنظمات فسيولوجية للتوازن العضوي ومؤشرات مهمة للأمراض. وفي غضون ذلك، بدأت تظهر إمكاناتها الهائلة لإنشاء علاجات للأمراض يمكن السيطرة عليها ويمكن السيطرة عليها. يمكن للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) إطلاق كميات كبيرة من EVs في الثقافة ، والتي أظهرت وعدا ببدء تجديد الأنسجة بشكل فعال وتسهيل التطبيقات العلاجية واسعة النطاق مع قابلية جيدة للتوسع والتكاثر. هناك طلب متزايد على بروتوكولات بسيطة وفعالة لجمع وتطبيق MSC-EVs. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل يعتمد على الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية التمثيلية من MSCs البشرية المستزرعة ، والإكسوسومات ، والحويصلات الدقيقة لمزيد من التطبيقات. تظهر قابلية التكيف لهذه الطريقة لسلسلة من الأساليب النهائية ، مثل وضع العلامات ، والزرع المحلي ، والحقن الجهازي. سيعالج تنفيذ هذا الإجراء الحاجة إلى جمع MSC-EVs وتطبيقها بشكل بسيط وموثوق في الأبحاث الانتقالية.
Introduction
الخلايا الجذعية هي خلايا متعددة القدرات غير متمايزة ذات قدرة على التجديد الذاتي وإمكانات متعدية1. يتم عزل الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) بسهولة وزراعتها وتوسيعها وتنقيتها في المختبر ، والتي تظل مميزة للخلايا الجذعية بعد ممرات متعددة. في السنوات الأخيرة ، دعمت الأدلة المتزايدة الرأي القائل بأن MSCs تعمل في وضع paracrine في الاستخدام العلاجي 2,3. يلعب إفراز الحويصلات خارج الخلية (EVs) بشكل خاص دورا حاسما في التوسط في الوظائف البيولوجية ل MSCs. كجسيمات نانوية غشائية غير متجانسة يتم إطلاقها من معظم أنواع الخلايا ، تتكون EVs من فئات فرعية تسمى exosomes (Exos) ، والحويصلات الدقيقة (MVs) ، وحتى الأجسام المبرمج الأكبر 4,5. من بينها ، Exos هو EV الأكثر دراسة على نطاق واسع بحجم 40-150 نانومتر ، وهو من أصل endosomal ويفرز بنشاط في الظروف الفسيولوجية. تتشكل MVs عن طريق سفك مباشرة من سطح غشاء بلازما الخلية بقطر 100-1000 نانومتر ، والتي تتميز بالتعبير العالي عن الفوسفاتيديل سيرين والتعبير عن العلامات السطحية للخلايا المانحة6. تحتوي EVs على الحمض النووي الريبي والبروتينات والجزيئات النشطة بيولوجيا الأخرى ، والتي لها وظائف مماثلة للخلايا الأم وتلعب دورا مهما في اتصال الخلايا والاستجابة المناعية وإصلاح تلف الأنسجة7. تم التحقيق على نطاق واسع في MSC-EVs كأداة علاجية قوية خالية من الخلايا في الطب التجديدي8.
يعد عزل وتنقية المركبات الكهربائية المشتقة من MSC مشكلة شائعة في مجال البحث والتطبيق. في الوقت الحاضر ، الطرد المركزي التفاضلي والكثافة9 ، عملية الترشيح الفائق 10 ، الفصل المغناطيسي المناعي 11 ، كروماتوجراف الاستبعاد الجزيئي12 ، ورقاقة الموائع الدقيقة13 هي طرق مستخدمة على نطاق واسع في عزل وتنقية المركبات الكهربائية. مع مزايا وعيوب كل نهج ، لا يمكن تلبية كمية ونقاء ونشاط المركبات الكهربائية المجمعة في نفس الوقت14,15. في هذه الدراسة ، يتم عرض بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية من MSCs المستزرعة بالتفصيل ، مما دعم الاستخدام العلاجي الفعال16،17،18،19،20. كما تم تقديم مثال على قابلية هذه الطريقة للتكيف مع سلسلة من الأساليب النهائية ، مثل وضع العلامات الفلورية ، والزرع المحلي ، والحقن الجهازي. سيعالج تنفيذ هذا الإجراء الحاجة إلى جمع وتطبيق MSC-EVs بشكل بسيط وموثوق في الأبحاث الانتقالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تظهر المركبات الكهربائية لتلعب دورا مهما في الأنشطة البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك عرض المستضد ، ونقل المواد الوراثية ، وتعديل البيئة الدقيقة للخلايا ، وغيرها. علاوة على ذلك ، فإن تطبيقها على نطاق واسع يجلب مناهج وفرصا جديدة لتشخيص الأمراض وعلاجها21. يعتمد تنفيذ التطبيقات ا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000974 و 81930025 و 82170988) ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2019M663986 و BX20190380). نحن ممتنون للمساعدة المقدمة من المركز الوطني التجريبي للتدريس التجريبي للطب الأساسي (AMFU) والمختبر المركزي التحليلي والاختبار لمركز الابتكار الطبي العسكري التابع لجامعة الطب للقوات الجوية.
Materials
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
Referências
- Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).
- Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
- Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
- Lei, L. M., et al. Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996 (2021).
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , 22 (2006).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
- Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
- Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).
- Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).
- He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).
- Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
- Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
- Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
- Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).
- Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).
