Isolatie, karakterisering en therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes uit gekweekte menselijke mesenchymale stamcellen

Summary

Dit protocol beschrijft de differentiële centrifugatie voor het isoleren en karakteriseren van representatieve EV’s (exosomen en microvesicles) uit gekweekte menselijke MSC’s. Verdere toepassingen van deze EV’s worden in dit artikel ook toegelicht.

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EV’s) zijn heterogene membraannanodeeltjes die door de meeste celtypen worden vrijgegeven en ze worden steeds meer erkend als fysiologische regulatoren van organismale homeostase en belangrijke indicatoren van pathologieën; In de tussentijd ontstaat hun immense potentieel om toegankelijke en controleerbare ziektetherapieën op te zetten. Mesenchymale stamcellen (MSC’s) kunnen grote hoeveelheden EV’s in cultuur vrijgeven, die veelbelovend zijn gebleken om effectieve weefselregeneratie op gang te brengen en uitgebreide therapeutische toepassingen met goede schaalbaarheid en reproduceerbaarheid mogelijk te maken. Er is een groeiende vraag naar eenvoudige en effectieve protocollen voor het verzamelen en toepassen van MSC-EV’s. Hier wordt een gedetailleerd protocol geleverd op basis van differentiële centrifugatie om representatieve EV’s te isoleren en te karakteriseren uit gekweekte menselijke MSC’s, exosomen en microvesicles voor verdere toepassingen. Het aanpassingsvermogen van deze methode wordt aangetoond voor een reeks downstream-benaderingen, zoals etikettering, lokale transplantatie en systemische injectie. De implementatie van deze procedure zal tegemoetkomen aan de behoefte aan eenvoudige en betrouwbare MSC-EV’s die worden verzameld en toegepast in translationeel onderzoek.

Introduction

Stamcellen zijn ongedifferentieerde pluripotente cellen met zelfvernieuwingsvermogen en translatiepotentieel¹. Mesenchymale stamcellen (MSC’s) worden gemakkelijk geïsoleerd, gekweekt, uitgebreid en gezuiverd in het laboratorium, wat kenmerkend blijft voor stamcellen na meerdere passages. In de afgelopen jaren is er steeds meer bewijs dat de opvatting ondersteunt dat MSC’s in een paracriene modus werken bij therapeutisch gebruik ^2,3. Vooral de afscheiding van extracellulaire blaasjes (EV’s) speelt een cruciale rol bij het bemiddelen van de biologische functies van MSC’s. Als heterogene vliezige nanodeeltjes die vrijkomen uit de meeste celtypen, bestaan EV’s uit subcategorieën die exosomen (Exos), microvesicles (MV’s) en nog grotere apoptotische lichamen^{worden genoemd 4,5}. Onder hen is Exos de meest bestudeerde EV met een grootte van 40-150 nm, die van endosomale oorsprong is en actief wordt uitgescheiden in fysiologische omstandigheden. MV’s worden gevormd door rechtstreeks van het oppervlak van het celplasmamembraan af te stoten met een diameter van 100-1.000 nm, die worden gekenmerkt door een hoge expressie van fosfatidylserine en expressie van oppervlaktemarkers van donorcellen⁶. EV’s bevatten RNA, eiwitten en andere bioactieve moleculen, die vergelijkbare functies hebben als de oudercellen en een belangrijke rol spelen bij celcommunicatie, immuunrespons en herstel van weefselschade⁷. MSC-EV’s zijn op grote schaal onderzocht als een krachtig celvrij therapeutisch hulpmiddel in regeneratieve geneeskunde⁸.

Isolatie en zuivering van MSC-afgeleide EV’s is een veel voorkomend probleem op het gebied van onderzoek en toepassing. Op dit moment zijn differentiële en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie⁹, ultrafiltratieproces 10, immunomagnetische scheiding¹¹, moleculaire uitsluitingschromatograaf 12 en microfluïdische chip¹³ veelgebruikte methoden bij de isolatie en zuivering van EV’s. Met de voor- en nadelen van elke aanpak kan niet tegelijkertijd worden voldaan aan de hoeveelheid, zuiverheid en activiteit van ingezamelde EV’s^14,15. In de huidige studie wordt het differentiële centrifugatieprotocol van isolatie en karakterisering van EV’s uit gekweekte MSC’s in detail getoond, wat efficiënt therapeutisch gebruik heeft ondersteund 16,17,18,19,20. Het aanpassingsvermogen van deze methode voor een reeks downstream-benaderingen, zoals fluorescerende etikettering, lokale transplantatie en systemische injectie, is verder geïllustreerd. De implementatie van deze procedure zal tegemoetkomen aan de behoefte aan eenvoudige en betrouwbare verzameling en toepassing van MSC-EV’s in translationeel onderzoek.

Protocol

Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Fourth Military Medical University en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Acht weken oude C57Bl/6-muizen (geen voorkeur voor vrouwtjes of mannetjes) werden gebruikt. Gecryopreserveerde mkstreng-afgeleide MSC’s (UCMSC’s), die voor deze studie werden gebruikt, werden verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen). Het gebruik v…

Representative Results

MV’s en Exo’s van gekweekte menselijke UCMSC’s worden geïsoleerd volgens de experimentele workflow (figuur 1). De NTA-resultaten tonen aan dat de grootte van Exos van menselijke MSC’s varieert van 40 nm tot 335 nm met een piekgrootte van ongeveer 100 nm, en de grootte van MV’s varieert van 50 nm tot 445 nm met een piekgrootte van 150 nm (figuur 2). Morfologische karakterisering van MSC-afgeleide Exo’s vertonen een typische bekervorm (figuur…

Discussion

EV’s zijn in opkomst om een belangrijke rol te spelen in diverse biologische activiteiten, waaronder antigeenpresentatie, genetisch materiaaltransport, celmicro-omgevingsmodificatie en andere. Bovendien brengt hun brede toepassing nieuwe benaderingen en mogelijkheden voor het diagnosticeren en behandelen van ziekten²¹. Implementatie van therapeutische toepassingen van EV’s is gebaseerd op succesvolle isolatie en karakterisering. Vanwege het gebrek aan gestandaardiseerde isolatie- en zuiveringsmeth…

Materials

10% povidone-iodine (Betadine)	Weizhenyuan	10053956954292	Wound disinfection
Calibration solution	Particle Metrix	110-0020	Calibrate the NTA instrument
Carprofen	Sigma	53716-49-7	Analgesic medicine
Caudal vein imager	KEW Life Science	KW-XXY	Caudal vein imager
Centrifuge	Eppendorf	5418R	Centrifugation
Fatal bovine serum	Corning	35-081-CV	Culture of UCMSCs
Formvar/carbon-coated square mesh	PBL Assay Science	24916-25	Transmission electron microscope
Heating pad	Zhongke Life Science	Z8G5JBMz	Post-treatment care of animals
Heparin Solution	StemCell	7980	Systemic injection
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22	Animal anesthesia
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Culture of UCMSCs
Nanoparticle tracking analyzer	Particle Metrix	ZetaView PMX120	Nanoparticle tracking analysis
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Resuspend EVs
Penicillin/Streptomycin	Procell Life Science	PB180120	Culture of UCMSCs
Phosphotungstic acid	Solarbio	12501-23-4	Transmission electron microscope
Pipette	Eppendorf	3120000224
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma-Aldrich	MINI26	Labeling EVs
Skin biopsy punch	Acuderm	69038-10-50	Skin defects
Software ZetaView	Particle Metrix	Version 8.05.14 SP7
Thermostatic equipment	Grant	v-0001-0005	Water bath
Transmission electron microscope	HITACHI	HT7800	Transmission electron microscope
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	Commercially UCMSCs
Ultracentrifuge	Beckman	XPN-100	Centrifugation
Ultrapure filtered water purification system	Milli-Q	IQ 7000	Preparation of ultrapure water