Aislamiento, caracterización y aplicación terapéutica de vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales humanas cultivadas
Summary
El presente protocolo describe la centrifugación diferencial para aislar y caracterizar EVs representativas (exosomas y microvesículas) de MSCs humanas cultivadas. Otras aplicaciones de estos vehículos eléctricos también se explican en este artículo.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EV) son nanopartículas de membrana heterogéneas liberadas por la mayoría de los tipos de células, y se reconocen cada vez más como reguladores fisiológicos de la homeostasis de los organismos e indicadores importantes de patologías; Mientras tanto, está surgiendo su inmenso potencial para establecer terapias de enfermedades accesibles y controlables. Las células madre mesenquimales (MSC) pueden liberar grandes cantidades de EV en cultivo, que han demostrado ser prometedoras para impulsar la regeneración efectiva de tejidos y facilitar amplias aplicaciones terapéuticas con buena escalabilidad y reproducibilidad. Existe una creciente demanda de protocolos simples y efectivos para recopilar y aplicar MSC-EV. Aquí, se proporciona un protocolo detallado basado en la centrifugación diferencial para aislar y caracterizar EV representativos de MSC humanas cultivadas, exosomas y microvesículas para aplicaciones adicionales. La adaptabilidad de este método se muestra para una serie de enfoques posteriores, como el etiquetado, el trasplante local y la inyección sistémica. La implementación de este procedimiento abordará la necesidad de una recopilación y aplicación de MSC-EV simples y confiables en la investigación traslacional.
Introduction
Las células madre son células pluripotentes indiferenciadas con capacidad de autorrenovación y potencial traslacional1. Las células madre mesenquimales (MSC) se aíslan, cultivan, expanden y purifican fácilmente en el laboratorio, lo que sigue siendo característico de las células madre después de múltiples pasajes. En los últimos años, la creciente evidencia ha apoyado la opinión de que las CMM actúan en modo paracrino en el uso terapéutico 2,3. Especialmente la secreción de vesículas extracelulares (EV) juega un papel crucial en la mediación de las funciones biológicas de las MSC. Como nanopartículas membranosas heterogéneas liberadas de la mayoría de los tipos de células, los EV consisten en subcategorías denominadas exosomas (Exos), microvesículas (MV) e incluso cuerpos apoptóticos más grandes 4,5. Entre ellos, Exos es el EV más estudiado con un tamaño de 40-150 nm, que es de origen endosomal y se secreta activamente en condiciones fisiológicas. Las MV se forman por desprendimiento directo de la superficie de la membrana plasmática celular con un diámetro de 100-1.000 nm, que se caracterizan por una alta expresión de fosfatidilserina y expresión de marcadores superficiales de células donantes6. Los EV contienen ARN, proteínas y otras moléculas bioactivas, que tienen funciones similares a las de las células progenitoras y desempeñan un papel importante en la comunicación celular, la respuesta inmune y la reparación del daño tisular7. Los MSC-EV han sido ampliamente investigados como una poderosa herramienta terapéutica libre de células en medicina regenerativa8.
El aislamiento y la purificación de los vehículos eléctricos derivados de MSC es un problema común en el campo de la investigación y la aplicación. En la actualidad, la ultracentrifugación de gradiente diferencial y de densidad9, el proceso de ultrafiltración 10, la separación inmunomagnética11, el cromatógrafo de exclusión molecular 12 y el chip microfluídico13 son métodos ampliamente empleados en el aislamiento y purificación de EV. Con las ventajas y desventajas de cada enfoque, la cantidad, pureza y actividad de los vehículos eléctricos recolectados no pueden satisfacerse al mismo tiempo14,15. En el presente estudio, se muestra en detalle el protocolo de centrifugación diferencial de aislamiento y caracterización de EVs a partir de MSCs cultivadas, lo que ha apoyado el uso terapéutico eficiente 16,17,18,19,20. La adaptabilidad de este método para una serie de enfoques posteriores, como el etiquetado fluorescente, el trasplante local y la inyección sistémica, se ha ejemplificado aún más. La implementación de este procedimiento abordará la necesidad de una recopilación y aplicación simple y confiable de MSC-EV en la investigación traslacional.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los EV están emergiendo para desempeñar un papel importante en diversas actividades biológicas, incluida la presentación de antígenos, el transporte de material genético, la modificación del microambiente celular y otros. Además, su amplia aplicación trae nuevos enfoques y oportunidades para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades21. La implementación de las aplicaciones terapéuticas de las EV se basa en el aislamiento y la caracterización exitosos. Sin embargo, debido a la falta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32000974, 81930025 y 82170988) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2019M663986 y BX20190380). Estamos agradecidos por la asistencia del Centro Nacional de Demostración de Enseñanza Experimental para Medicina Básica (AMFU) y el Laboratorio Central de Análisis y Pruebas del Centro de Innovación Médica Militar de la Universidad Médica de la Fuerza Aérea.
Materials
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
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