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Biologia

培養ヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の単離、特性評価、および治療応用

Published: September 23, 2022
doi:
10.3791/64135
, , , , , , ,
1College of Life Science,Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology,Fourth Military Medical University, 3Xi’an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine,Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology,Fourth Military Medical University

Summary

本プロトコルは、培養ヒト間葉系幹細胞から代表的なEV(エキソソームおよびマイクロベシクル)を単離および特性評価するための差動遠心分離について説明しています。これらのEVのさらなる用途についても、本稿で解説しています。

Abstract

細胞外小胞(EV)は、ほとんどの細胞型によって放出される不均一な膜ナノ粒子であり、生物の恒常性の生理学的調節因子および病状の重要な指標としてますます認識されています。その間、アクセス可能で制御可能な疾患治療薬を確立するための彼らの計り知れない可能性が浮上しています。間葉系幹細胞(MSC)は、培養中に大量のEVを放出することができ、効果的な組織再生を促進し、優れたスケーラビリティと再現性を備えた広範な治療アプリケーションを促進することが期待されています。MSC-EVを収集して適用するためのシンプルで効果的なプロトコルに対する需要が高まっています。ここでは、さらなる応用のために培養ヒトMSC、エクソソーム、およびマイクロベシクルから代表的なEVを単離および特性評価するための、差動遠心分離に基づく詳細なプロトコルを提供します。この方法の適応性は、標識、局所移植、全身注射などの一連の下流アプローチに対して示されています。この手順の実施により、シンプルで信頼性の高いMSC-EVの収集とトランスレーショナルリサーチへの応用の必要性に対処します。

Introduction

幹細胞は、自己複製能と翻訳能を持つ未分化多能性細胞です1。間葉系幹細胞(MSC)は、実験室で簡単に分離、培養、増殖、精製でき、複数回継代しても幹細胞の特徴が残ります。近年、MSCが治療目的でパラクリンモードで作用するという見解を支持する証拠が増えています2,3。特に細胞外小胞(EV)の分泌は、間葉系幹細胞の生物学的機能を媒介する上で重要な役割を果たしています。ほとんどの細胞型から放出される不均一な膜性ナノ粒子として、EVはエキソソーム(Exo)、マイクロベシクル(MV)、およびさらに大きなアポトーシス体と呼ばれるサブカテゴリで構成されています4,5。その中で、Exosは40〜150nmのサイズを有する最も広く研究されているEVであり、これはエンドソーム起源であり、生理学的条件下で活発に分泌される。MVは、直径100〜1,000nmの細胞原形質膜の表面から直接脱落することによって形成され、これはホスファチジルセリンの高発現およびドナー細胞の表面マーカーの発現を特徴とする6。EVにはRNA、タンパク質、その他の生理活性分子が含まれており、これらは親細胞と同様の機能を持ち、細胞コミュニケーション、免疫応答、組織損傷修復に重要な役割を果たします7。MSC-EVは、再生医療における強力な無細胞治療ツールとして広く研究されています8。

MSC由来のEVの単離と精製は、研究と応用の分野で共通の問題です。現在、示差および密度勾配超遠心分離9、限外ろ過プロセス10、免疫磁気分離11、分子排除クロマトグラフ12、およびマイクロ流体チップ13は、EVの単離および精製に広く採用されている方法である。それぞれのアプローチの長所と短所により、収集されたEVの量、純度、および活性を同時に満たすことはできません14,15。本研究では、培養MSCからのEVの分離と特性評価の差動遠心分離プロトコルが詳細に示され、効率的な治療的使用をサポートしてきました16、17、18、19、20。蛍光標識、局所移植、全身注射などの一連の下流アプローチに対するこの方法の適応性がさらに例示されています。この手順を実施することで、トランスレーショナルリサーチにおけるMSC-EVの簡単で信頼性の高い収集と適用の必要性に対処できます。

Protocol

すべての動物の手順は、第4軍事医科大学の動物管理および使用委員会によって承認され、実験動物の世話と使用のための国立衛生研究所ガイドに従って実施されました。8週齢のC57Bl/6マウス(雌または雄のいずれの選好もしない)を使用した。本研究に使用された凍結保存されたヒト臍帯由来MSC(UCMSC)は、商業的な供給源から入手した( 資料表を参照)。ヒト細胞の使用は、第4軍事医?…

Representative Results

培養ヒトUCMSCからのMVおよびExoは、実験ワークフローに従って単離されます(図1)。NTAの結果は、ヒト間葉系幹細胞由来のExosのサイズが40 nmから335 nmの範囲でピークサイズが約100 nmであり、MVのサイズが50 nmから445 nmの範囲でピークサイズが150 nmであることを示しています(図2)。MSC由来のExosの形態学的特性は、典型的なカップ形状を示します(<strong clas…

Discussion

EVは、抗原提示、遺伝物質輸送、細胞微小環境改変など、多様な生物学的活動において重要な役割を果たすようになっています。さらに、それらの幅広いアプリケーションは、病気の診断と治療のための新しいアプローチと機会をもたらします21。EVの治療用途の実装は、分離と特性評価の成功に基づいています。しかし、標準化された単離精製方法がなく、抽出効率が低い?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学財団(32000974、81930025、82170988)および中国ポスドク科学財団(2019M663986およびBX20190380)からの助成金によってサポートされました。基礎医学のための国立実験教育デモンストレーションセンター(AMFU)と空軍医科大学の軍事医療イノベーションセンターの分析および試験中央研究所の支援に感謝します。

Materials

10% povidone-iodine (Betadine) Weizhenyuan 10053956954292 Wound disinfection
Calibration solution Particle Metrix 110-0020 Calibrate the NTA instrument
Carprofen Sigma 53716-49-7 Analgesic medicine
Caudal vein imager  KEW Life Science KW-XXY Caudal vein imager
Centrifuge Eppendorf 5418R Centrifugation
Fatal bovine serum Corning 35-081-CV Culture of UCMSCs
Formvar/carbon-coated square mesh PBL Assay Science  24916-25 Transmission electron microscope
Heating pad Zhongke Life Science Z8G5JBMz Post-treatment care of animals
Heparin Solution StemCell 7980 Systemic injection
Isoflurane RWD Life Science R510-22 Animal anesthesia
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) Gibco C12571500BT Culture of UCMSCs
Nanoparticle tracking analyzer Particle Metrix ZetaView PMX120 Nanoparticle tracking analysis
PBS (1x) Meilunbio MA0015 Resuspend EVs
Penicillin/Streptomycin Procell Life Science PB180120 Culture of UCMSCs
Phosphotungstic acid Solarbio 12501-23-4 Transmission electron microscope
Pipette Eppendorf 3120000224
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit Sigma-Aldrich MINI26 Labeling EVs
Skin biopsy punch Acuderm 69038-10-50 Skin defects
Software ZetaView Particle Metrix Version 8.05.14 SP7 
Thermostatic equipment Grant v-0001-0005 Water bath
Transmission electron microscope HITACHI HT7800 Transmission electron microscope
UCMSCs Bai'ao  UKK220201 Commercially UCMSCs
Ultracentrifuge Beckman XPN-100 Centrifugation
Ultrapure filtered water purification system Milli-Q IQ 7000 Preparation of ultrapure water
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Keywords: Extracellular VesiclesMesenchymal Stem CellsIsolationCharacterizationDifferential CentrifugationCell CultureTherapeutic ApplicationPKH26 DyeParticle Tracking Analysis
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Citar este artigo
Xing, S., Zhang, K., Tang, S., Liu, L., Cao, Y., Zheng, C., Sui, B., Jin, Y. Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (187), e64135, doi:10.3791/64135 (2022).
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