Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması
Summary
Mevcut protokol, temsili EV’leri (eksozomlar ve mikro-parçacıklar) kültürlü insan MSC’lerinden izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeyi açıklamaktadır. Bu EV’lerin diğer uygulamaları da bu makalede açıklanmaktadır.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EV’ler), çoğu hücre tipi tarafından salınan heterojen membran nanopartikülleridir ve organizma homeostazının fizyolojik düzenleyicileri ve patolojilerin önemli göstergeleri olarak giderek daha fazla tanınmaktadır; Bu arada, erişilebilir ve kontrol edilebilir hastalık terapötikleri oluşturmak için muazzam potansiyelleri ortaya çıkmaktadır. Mezenkimal kök hücreler (MSC’ler), etkili doku rejenerasyonunu hızlandırma ve iyi ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik ile kapsamlı terapötik uygulamaları kolaylaştırma sözü veren kültürde büyük miktarda EV’yi serbest bırakabilir. MSC-EV’lerin toplanması ve uygulanması için basit ve etkili protokollere yönelik artan bir talep vardır. Burada, temsili EV’leri kültürlü insan MSC’lerinden, eksozomlardan ve mikro-parçacıklardan izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeye dayanan ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu yöntemin uyarlanabilirliği, etiketleme, lokal transplantasyon ve sistemik enjeksiyon gibi bir dizi aşağı akış yaklaşımı için gösterilmiştir. Bu prosedürün uygulanması, translasyonel araştırmalarda basit ve güvenilir MSC-EV’lerin toplanması ve uygulanması ihtiyacını ele alacaktır.
Introduction
Kök hücreler kendini yenileme yeteneğine ve translasyonel potansiyele sahip farklılaşmamış pluripotent hücrelerdir1. Mezenkimal kök hücreler (MSC’ler) laboratuvarda kolayca izole edilir, kültürlenir, genişletilir ve saflaştırılır, bu da çoklu geçişlerden sonra kök hücrelerin karakteristiği olarak kalır. Son yıllarda, artan kanıtlar, MSC’lerin terapötik kullanımda parakrin modda hareket ettiği görüşünü desteklemektedir 2,3. Özellikle hücre dışı veziküllerin (EV) salgılanması, MSC’lerin biyolojik fonksiyonlarına aracılık etmede çok önemli bir rol oynamaktadır. Çoğu hücre tipinden salınan heterojen membranöz nanopartiküller olarak, EV’ler eksozomlar (Exos), mikro-parçacıklar (MV’ler) ve hatta daha büyük apoptotik cisimler 4,5 olarak adlandırılan alt kategorilerden oluşur. Bunlar arasında Exos, endozomal kökenli ve fizyolojik koşullarda aktif olarak salgılanan 40-150 nm büyüklüğünde en çok çalışılan EV’dir. MV’ler, yüksek fosfatidilserin ekspresyonu ve donör hücrelerin yüzey belirteçlerinin ekspresyonu ile karakterize edilen 100-1.000 nm çapında hücre plazma zarının yüzeyinden doğrudan dökülerek oluşturulur6. EV’ler, ana hücrelere benzer işlevlere sahip olan ve hücre iletişimi, bağışıklık tepkisi ve doku hasarı onarımında önemli bir rol oynayan RNA, proteinler ve diğer biyoaktif molekülleri içerir7. MSC-EV’ler, rejeneratif tıpta güçlü bir hücresiz terapötik araç olarak geniş çapta araştırılmıştır8.
MSC kaynaklı EV’lerin izolasyonu ve saflaştırılması, araştırma ve uygulama alanında yaygın bir konudur. Günümüzde, diferansiyel ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme9, ultrafiltrasyon işlemi 10, immünomanyetik ayırma 11, moleküler dışlama kromatografı12 ve mikroakışkan çip13, EV’lerin izolasyonunda ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Her yaklaşımın avantajları ve dezavantajları ile, toplanan EV’lerin miktarı, saflığı ve aktivitesi aynı anda karşılanamaz14,15. Bu çalışmada, EV’lerin kültürlü MSC’lerden izolasyonu ve karakterizasyonunun diferansiyel santrifüjleme protokolü ayrıntılı olarak gösterilmiş olup, etkin terapötik kullanımı desteklemiştir 16,17,18,19,20. Bu yöntemin floresan etiketleme, lokal transplantasyon ve sistemik enjeksiyon gibi bir dizi aşağı akış yaklaşımına uyarlanabilirliği daha da örneklenmiştir. Bu prosedürün uygulanması, MSC-EV’lerin çeviri araştırmalarında basit ve güvenilir bir şekilde toplanması ve uygulanması ihtiyacını ele alacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
EV’ler, antijen sunumu, genetik materyal taşınması, hücre mikroçevre modifikasyonu ve diğerleri dahil olmak üzere çeşitli biyolojik aktivitelerde önemli bir rol oynamak için ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, geniş uygulamaları hastalıkların teşhisi ve tedavisi için yeni yaklaşımlar ve fırsatlar getirmektedir21. EV’lerin terapötik uygulamalarının uygulanması, başarılı izolasyon ve karakterizasyona dayanmaktadır. Bununla birlikte, standartlaştırılmış izolasyon ve safla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32000974, 81930025 ve 82170988) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M663986 ve BX20190380) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir. Temel Tıp Ulusal Deneysel Öğretim Gösteri Merkezi (AMFU) ve Hava Kuvvetleri Tıp Üniversitesi Askeri Tıbbi İnovasyon Merkezi Analitik ve Test Merkez Laboratuvarı’nın yardımları için minnettarız.
Materials
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
Referências
- Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).
- Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
- Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
- Lei, L. M., et al. Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996 (2021).
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , 22 (2006).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
- Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
- Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).
- Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).
- He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).
- Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
- Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
- Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
- Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).
- Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).
