सुसंस्कृत मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से बाह्य पुटिकाओं का अलगाव, लक्षण वर्णन और चिकित्सीय अनुप्रयोग
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल सुसंस्कृत मानव एमएससी से प्रतिनिधि ईवी (एक्सोसोम और माइक्रोवेसिकल्स) को अलग करने और चिह्नित करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन का वर्णन करता है। इन ईवी के आगे के अनुप्रयोगों को भी इस लेख में समझाया गया है।
Abstract
एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) अधिकांश सेल प्रकारों द्वारा जारी विषम झिल्ली नैनोकणों हैं, और उन्हें जीव होमियोस्टैसिस के शारीरिक नियामकों और विकृति के महत्वपूर्ण संकेतकों के रूप में तेजी से पहचाना जाता है; इस बीच, सुलभ और नियंत्रणीय रोग चिकित्सा स्थापित करने की उनकी अपार क्षमता उभर रही है। मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) संस्कृति में बड़ी मात्रा में ईवी जारी कर सकते हैं, जिन्होंने प्रभावी ऊतक पुनर्जनन शुरू करने और अच्छी स्केलेबिलिटी और प्रजनन क्षमता के साथ व्यापक चिकित्सीय अनुप्रयोगों की सुविधा प्रदान करने का वादा दिखाया है। एमएससी-ईवी एकत्र करने और लागू करने के लिए सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल की बढ़ती मांग है। यहां, आगे के अनुप्रयोगों के लिए सुसंस्कृत मानव एमएससी, एक्सोसोम और माइक्रोवेसिकल्स से प्रतिनिधि ईवी को अलग करने और चिह्नित करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन के आधार पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। इस विधि की अनुकूलनशीलता डाउनस्ट्रीम दृष्टिकोणों की एक श्रृंखला के लिए दिखाई गई है, जैसे लेबलिंग, स्थानीय प्रत्यारोपण और प्रणालीगत इंजेक्शन। इस प्रक्रिया के कार्यान्वयन से ट्रांसलेशनल अनुसंधान में सरल और विश्वसनीय एमएससी-ईवी संग्रह और आवेदन की आवश्यकता को संबोधित किया जाएगा।
Introduction
स्टेम सेल स्व-नवीकरण क्षमता और ट्रांसलेशनल क्षमताके साथ उदासीन प्लुरिपोटेंट कोशिकाएं हैं। मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) प्रयोगशाला में आसानी से अलग, सुसंस्कृत, विस्तारित और शुद्ध होते हैं, जो कई मार्गों के बाद स्टेम कोशिकाओं की विशेषता बनी रहती है। हाल के वर्षों में, बढ़ते सबूतों ने इस दृष्टिकोण का समर्थन किया है कि एमएससी चिकित्सीय उपयोग 2,3 में पैराक्रिन मोड में कार्य करते हैं। विशेष रूप से बाह्य पुटिकाओं (ईवी) का स्राव एमएससी के जैविक कार्यों की मध्यस्थता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। अधिकांश सेल प्रकारों से जारी विषम झिल्लीदार नैनोकणों के रूप में, ईवी में एक्सोसोम (एक्सोस), माइक्रोवेसिकल्स (एमवी) और यहां तक कि बड़े एपोप्टोटिक बॉडी 4,5 नामक उपश्रेणियां होती हैं। उनमें से, एक्सोस 40-150 एनएम के आकार के साथ सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किया गया ईवी है, जो एक एंडोसोमल मूल का है और शारीरिक स्थितियों में सक्रिय रूप से स्रावित होता है। एमवी का निर्माण 100-1,000 एनएम के व्यास के साथ सेल प्लाज्मा झिल्ली की सतह से सीधे बहकर किया जाता है, जो फॉस्फेटिडिलसेरिन की उच्च अभिव्यक्ति औरदाता कोशिकाओं के सतह मार्करों की अभिव्यक्ति की विशेषता है। ईवी में आरएनए, प्रोटीन और अन्य बायोएक्टिव अणु होते हैं, जिनके मूल कोशिकाओं के समान कार्य होते हैं और सेल संचार, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ऊतकक्षति की मरम्मत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एमएससी-ईवी को पुनर्योजी चिकित्सा8 में एक शक्तिशाली सेल-मुक्त चिकित्सीय उपकरण के रूप में व्यापक रूप से जांच की गई है।
एमएससी-व्युत्पन्न ईवी का अलगाव और शुद्धिकरण अनुसंधान और अनुप्रयोग के क्षेत्र में एक आम मुद्दा है। वर्तमान में, अंतर और घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन9, अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रिया 10, इम्यूनोमैग्नेटिक पृथक्करण11, आणविक बहिष्करण क्रोमैटोग्राफ 12, और माइक्रोफ्लुइडिक चिप13 ईवी के अलगाव और शुद्धिकरण में व्यापक रूप से नियोजित तरीके हैं। प्रत्येक दृष्टिकोण के फायदे और नुकसान के साथ, एकत्र किए गए ईवी की मात्रा, शुद्धता और गतिविधि को एक ही समय मेंसंतुष्ट नहीं किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में, सुसंस्कृत एमएससी से ईवी के अलगाव और लक्षण वर्णन के अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन प्रोटोकॉल को विस्तार से दिखाया गया है, जिसने कुशल चिकित्सीय उपयोग 16,17,18,19,20 का समर्थन किया है। फ्लोरोसेंट लेबलिंग, स्थानीय प्रत्यारोपण और प्रणालीगत इंजेक्शन जैसे डाउनस्ट्रीम दृष्टिकोणों की एक श्रृंखला के लिए इस विधि की अनुकूलनशीलता को आगे उदाहरण दिया गया है। इस प्रक्रिया को लागू करने से ट्रांसलेशनल अनुसंधान में एमएससी-ईवी के सरल और विश्वसनीय संग्रह और अनुप्रयोग की आवश्यकता को संबोधित किया जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
एंटीजन प्रस्तुति, आनुवंशिक सामग्री परिवहन, सेल माइक्रोएन्वायरमेंट संशोधन और अन्य सहित विभिन्न जैविक गतिविधियों में ईवी एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए उभर रहे हैं। इसके अलावा, उनका व्यापक…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32000974, 81930025 और 82170988) और चीन पोस्टडॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (2019 एम 663986 और बीएक्स 20190380) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम नेशनल एक्सपेरिमेंटल टीचिंग डेमॉन्स्ट्रेशन सेंटर फॉर बेसिक मेडिसिन (एएमएफयू) और वायु सेना मेडिकल यूनिवर्सिटी के सैन्य चिकित्सा नवाचार केंद्र के विश्लेषणात्मक और परीक्षण केंद्रीय प्रयोगशाला की सहायता के लिए आभारी हैं।
Materials
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
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