Il presente protocollo descrive la centrifugazione differenziale per isolare e caratterizzare EV rappresentative (esosomi e microvescicole) da MSC umane in coltura. Ulteriori applicazioni di questi veicoli elettrici sono spiegate anche in questo articolo.
Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle di membrana eterogenee rilasciate dalla maggior parte dei tipi cellulari e sono sempre più riconosciute come regolatori fisiologici dell’omeostasi dell’organismo e importanti indicatori di patologie; Nel frattempo, sta emergendo il loro immenso potenziale per stabilire terapie di malattia accessibili e controllabili. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) possono rilasciare grandi quantità di EV in coltura, che hanno dimostrato di promettere di avviare un’efficace rigenerazione dei tessuti e facilitare ampie applicazioni terapeutiche con una buona scalabilità e riproducibilità. C’è una crescente domanda di protocolli semplici ed efficaci per la raccolta e l’applicazione di MSC-EV. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato basato sulla centrifugazione differenziale per isolare e caratterizzare EV rappresentativi da MSC umane in coltura, esosomi e microvescicole per ulteriori applicazioni. L’adattabilità di questo metodo è dimostrata per una serie di approcci a valle, come l’etichettatura, il trapianto locale e l’iniezione sistemica. L’implementazione di questa procedura risponderà alla necessità di una raccolta e di un’applicazione semplici e affidabili di MSC-EV nella ricerca traslazionale.
Le cellule staminali sono cellule pluripotenti indifferenziate con capacità di auto-rinnovamento e potenziale traslazionale1. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono facilmente isolate, coltivate, espanse e purificate in laboratorio, il che rimane caratteristico delle cellule staminali dopo più passaggi. Negli ultimi anni, prove crescenti hanno sostenuto l’opinione che le MSC agiscono in modo paracrino nell’uso terapeutico 2,3. Soprattutto la secrezione di vescicole extracellulari (EV) svolge un ruolo cruciale nel mediare le funzioni biologiche delle MSC. Come nanoparticelle membranose eterogenee rilasciate dalla maggior parte dei tipi di cellule, le EV consistono in sottocategorie denominate esosomi (Exos), microvescicole (MV) e corpi apoptotici ancora più grandi 4,5. Tra questi, Exos è l’EV più studiato con una dimensione di 40-150 nm, che è di origine endosomiale e attivamente secreto in condizioni fisiologiche. Le MV si formano spargendo direttamente dalla superficie della membrana plasmatica cellulare con un diametro di 100-1.000 nm, che sono caratterizzate da un’elevata espressione di fosfatidilserina e dall’espressione di marcatori superficiali di cellule donatrici6. Le EV contengono RNA, proteine e altre molecole bioattive, che hanno funzioni simili alle cellule madri e svolgono un ruolo significativo nella comunicazione cellulare, nella risposta immunitaria e nella riparazione dei danni tissutali7. Le MSC-EV sono state ampiamente studiate come un potente strumento terapeutico privo di cellule nella medicina rigenerativa8.
L’isolamento e la purificazione dei veicoli elettrici derivati da MSC è un problema comune nel campo della ricerca e dell’applicazione. Allo stato attuale, l’ultracentrifugazione differenziale e a gradiente di densità9, il processo di ultrafiltrazione10, la separazione immunomagnetica 11, il cromatografo ad esclusione molecolare 12 e il chip microfluidico13 sono metodi ampiamente impiegati nell’isolamento e nella purificazione delle EV. Con i vantaggi e gli svantaggi di ciascun approccio, la quantità, la purezza e l’attività dei veicoli elettrici raccolti non possono essere soddisfatti contemporaneamente14,15. Nel presente studio, viene mostrato in dettaglio il protocollo di centrifugazione differenziale di isolamento e caratterizzazione delle EV da MSC in coltura, che ha supportato un uso terapeutico efficiente 16,17,18,19,20. L’adattabilità di questo metodo per una serie di approcci a valle, come la marcatura fluorescente, il trapianto locale e l’iniezione sistemica, è stata ulteriormente esemplificata. L’implementazione di questa procedura risponderà alla necessità di una raccolta e di un’applicazione semplici e affidabili delle MSC-EV nella ricerca traslazionale.
Le EV stanno emergendo per svolgere un ruolo importante in diverse attività biologiche, tra cui la presentazione dell’antigene, il trasporto di materiale genetico, la modifica del microambiente cellulare e altri. Inoltre, la loro ampia applicazione offre nuovi approcci e opportunità per la diagnosi e il trattamento delle malattie21. L’implementazione delle applicazioni terapeutiche delle EV si basa sul successo dell’isolamento e della caratterizzazione. Tuttavia, a causa della mancanza di metodi…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (32000974, 81930025 e 82170988) e della China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 e BX20190380). Siamo grati per l’assistenza del National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) e del Analytical and Testing Central Laboratory of Military Medical Innovation Center dell’Air Force Medical University.
10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |