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Biologia

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

Published: September 23, 2022
doi:
10.3791/64135
, , , , , , ,
1College of Life Science,Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology,Fourth Military Medical University, 3Xi’an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine,Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology,Fourth Military Medical University

Summary

본 프로토콜은 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 대표적인 EV(엑소좀 및 마이크로베시클)를 분리하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 설명합니다. 이러한 EV의 추가 응용 프로그램도 이 기사에서 설명합니다.

Abstract

세포외 소포(EV)는 대부분의 세포 유형에서 방출되는 이질적인 막 나노입자이며 유기체 항상성의 생리학적 조절자 및 병리학의 중요한 지표로 점점 더 인식되고 있습니다. 한편, 접근 가능하고 통제 가능한 질병 치료제를 확립할 수 있는 엄청난 잠재력이 나타나고 있습니다. 중간엽 줄기 세포(MSC)는 배양 시 다량의 EV를 방출할 수 있으며, 이는 효과적인 조직 재생을 촉진하고 우수한 확장성과 재현성으로 광범위한 치료 적용을 촉진할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. MSC-EV를 수집하고 적용하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜에 대한 요구가 증가하고 있습니다. 여기서는 추가 응용 분야를 위해 배양된 인간 중간엽, 엑소좀 및 마이크로베지클에서 대표적인 EV를 분리하고 특성화하기 위해 차등 원심분리를 기반으로 하는 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 방법의 적응성은 라벨링, 국소 이식 및 전신 주입과 같은 일련의 다운스트림 접근 방식에 대해 표시됩니다. 이 절차의 구현은 중개 연구에서 간단하고 신뢰할 수 있는 MSC-EV 수집 및 적용의 필요성을 해결할 것입니다.

Introduction

줄기세포는 자가 재생 능력과 번역 잠재력이 있는 미분화 만능 세포입니다1. 중간엽 줄기세포(MSC)는 실험실에서 쉽게 분리, 배양, 확장 및 정제되며, 이는 여러 번 계대배양한 후에도 줄기세포의 특성을 유지합니다. 최근 몇 년 동안, 중간엽 줄기세포가 치료적 용도에서 측분비 방식으로 작용한다는 견해를 뒷받침하는 증거가 증가하고 있다 2,3. 특히 세포외 소포체(EV)의 분비는 중간엽 줄기세포의 생물학적 기능을 매개하는 데 중요한 역할을 합니다. 대부분의 세포 유형에서 방출되는 이질적인 막 나노입자인 EV는 엑소좀(Exos), 미세소포(MV) 및 더 큰 세포자멸사체(4,5)라는 하위 범주로 구성됩니다. 그 중 엑소스는 40-150nm 크기로 가장 널리 연구된 EV로 엔도솜 기원이며 생리학적 조건에서 활발하게 분비됩니다. MV는 직경 100-1,000nm의 세포 원형질막 표면에서 직접 탈락하여 형성되며, 이는 포스파티딜세린의 높은 발현과 공여 세포의 표면 마커의 발현을 특징으로 한다6. EV에는 RNA, 단백질 및 기타 생리 활성 분자가 포함되어 있으며, 이들은 모 세포와 유사한 기능을 가지며 세포 통신, 면역 반응 및 조직 손상 복구에 중요한 역할을 합니다7. MSC-EV는 재생 의학에서 강력한 무세포 치료 도구로 널리 연구되어 왔다8.

MSC 유래 EV의 분리 및 정제는 연구 및 응용 분야에서 공통적인 문제입니다. 현재, 차등 및 밀도 구배 초원심분리(9), 한외여과 공정(10), 면역자기 분리(11), 분자 배제 크로마토그래프(12) 및 미세유체 칩(13)이 EV의 분리 및 정제에 널리 사용되고 있다. 각 접근법의 장점과 단점으로 인해 수집 된 EV의 양, 순도 및 활성을 동시에 만족시킬 수 없습니다14,15. 본 연구에서, 배양된 중간엽 줄기세포로부터 EV의 분리 및 특성화에 대한 차등 원심분리 프로토콜이 상세히 제시되며, 이는 효율적인 치료 사용을 지원하였다 16,17,18,19,20. 형광 표지, 국소 이식 및 전신 주입과 같은 일련의 다운스트림 접근법에 대한 이 방법의 적응성이 추가로 예시되었습니다. 이 절차를 구현하면 중개 연구에서 MSC-EV의 간단하고 신뢰할 수 있는 수집 및 적용에 대한 필요성을 해결할 수 있습니다.

Protocol

모든 동물 시술은 제4군 의과대학 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원(National Institutes of Health Guide)의 실험 동물 관리 및 사용 가이드(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었습니다. 8주령의 C57Bl/6 마우스(암컷 또는 수컷 모두 선호 없음)를 사용했습니다. 본 연구에 사용된 냉동보존된 인간 탯줄 유래 중간엽(UCMSC)은 상업적 공급원으로부터 …

Representative Results

배양된 인간 UCMSC의 MV 및 엑소는 실험 워크플로우에 따라 분리됩니다(그림 1). NTA 결과는 인간 중간엽 줄기세포의 엑소 크기가 40nm에서 335nm까지 범위이고 피크 크기가 약 100nm이고 MV의 크기가 50nm에서 445nm이고 피크 크기가 150nm임을 보여줍니다(그림 2). MSC 유래 엑소의 형태학적 특성은 전형적인 컵 모양을 나타냅니다(그림 3). EV는 P…

Discussion

EV는 항원 제시, 유전 물질 수송, 세포 미세 환경 변형 등을 포함한 다양한 생물학적 활동에서 중요한 역할을 하기 위해 부상하고 있습니다. 또한, 질병의 광범위한 적용은 질병의 진단과 치료를 위한 새로운 접근법과 기회를 제공한다21. EV의 치료 응용 구현은 성공적인 분리 및 특성화를 기반으로 합니다. 그러나 표준화된 분리 및 정제 방법의 부족과 낮은 추출 효율로 인해 EV 연?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32000974, 81930025 및 82170988)과 중국 박사후 과학 재단 (2019M663986 및 BX20190380)의 보조금으로 지원되었습니다. 우리는 기초 의학을위한 국립 실험 교육 시범 센터 (AMFU)와 공군 의과 대학 군사 의료 혁신 센터의 분석 및 테스트 중앙 연구소의 도움에 감사드립니다.

Materials

10% povidone-iodine (Betadine) Weizhenyuan 10053956954292 Wound disinfection
Calibration solution Particle Metrix 110-0020 Calibrate the NTA instrument
Carprofen Sigma 53716-49-7 Analgesic medicine
Caudal vein imager  KEW Life Science KW-XXY Caudal vein imager
Centrifuge Eppendorf 5418R Centrifugation
Fatal bovine serum Corning 35-081-CV Culture of UCMSCs
Formvar/carbon-coated square mesh PBL Assay Science  24916-25 Transmission electron microscope
Heating pad Zhongke Life Science Z8G5JBMz Post-treatment care of animals
Heparin Solution StemCell 7980 Systemic injection
Isoflurane RWD Life Science R510-22 Animal anesthesia
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) Gibco C12571500BT Culture of UCMSCs
Nanoparticle tracking analyzer Particle Metrix ZetaView PMX120 Nanoparticle tracking analysis
PBS (1x) Meilunbio MA0015 Resuspend EVs
Penicillin/Streptomycin Procell Life Science PB180120 Culture of UCMSCs
Phosphotungstic acid Solarbio 12501-23-4 Transmission electron microscope
Pipette Eppendorf 3120000224
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit Sigma-Aldrich MINI26 Labeling EVs
Skin biopsy punch Acuderm 69038-10-50 Skin defects
Software ZetaView Particle Metrix Version 8.05.14 SP7 
Thermostatic equipment Grant v-0001-0005 Water bath
Transmission electron microscope HITACHI HT7800 Transmission electron microscope
UCMSCs Bai'ao  UKK220201 Commercially UCMSCs
Ultracentrifuge Beckman XPN-100 Centrifugation
Ultrapure filtered water purification system Milli-Q IQ 7000 Preparation of ultrapure water
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Referências

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Keywords: Extracellular VesiclesMesenchymal Stem CellsIsolationCharacterizationDifferential CentrifugationCell CultureTherapeutic ApplicationPKH26 DyeParticle Tracking Analysis
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Citar este artigo
Xing, S., Zhang, K., Tang, S., Liu, L., Cao, Y., Zheng, C., Sui, B., Jin, Y. Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (187), e64135, doi:10.3791/64135 (2022).
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