Summary
이 프로토콜에서는 생착 중 정맥 - 정맥 바이 패스를 사용하지 않고 20 시간 동안 기증자 장기를 정적 냉장 보관 한 후 돼지 동종 간 이식 모델을 설명합니다. 이 접근법은 무간기를 최소화하고 정교한 부피 및 혈압 강하제 관리와 함께 단순화 된 수술 기술을 사용합니다.
Abstract
간 이식은 다양한 치명적인 간 질환 치료를위한 황금 표준으로 간주됩니다. 그러나 만성 이식 실패, 지속적인 장기 기증자 부족, 한계 이식편의 사용 증가와 같은 해결되지 않은 문제는 장기 기계 관류의 구현과 같은 현재 개념의 개선을 요구합니다. 이식편 재조정 및 변조의 새로운 방법을 평가하기 위해서는 번역 모델이 필요합니다. 인간과의 해부학 적 및 생리 학적 유사성 및 이종 이식 분야의 최근 발전과 관련하여 돼지는 이식 모델에 사용되는 주요 대형 동물 종이되었습니다. Garnier et al.이 돼지 동종 간 이식 모델을 처음 도입 한 후 1965 년 지난 60 년 동안 몇 가지 수정 사항이 발표되었습니다.
특정 특정 해부학 적 특성으로 인해 무간기 동안 정맥 - 정맥 우회술은 혈역학 적 불안정성과 수술 전후 사망률을 초래하는 장 혼잡 및 허혈을 줄이기위한 필요성으로 간주됩니다. 그러나 바이 패스를 구현하면 절차의 기술적 및 물류 복잡성이 증가합니다. 또한 공기 색전증, 출혈 및 동시 비장 절제술의 필요성과 같은 관련 합병증이 이전에보고되었습니다.
이 프로토콜에서는 정맥 - 정맥 우회술을 사용하지 않고 돼지 동종 간 이식 모델을 설명합니다. 확장 된 기준 기증자 조건을 시뮬레이션하는 20 시간의 정적 냉장 보관 후 기증자 간의 생착은이 단순화 된 접근법이 중요한 혈역학 적 변화 또는 수술 중 사망률없이 간 기능의 규칙적인 흡수 (담즙 생성 및 간 특이 적 CYP1A2 대사에 의해 정의 됨)로 수행 될 수 있음을 보여줍니다. 이 접근법의 성공은 최적화 된 수술 기술과 정교한 마취 부피 및 혈압 강하제 관리에 의해 보장됩니다.
이 모델은 수술 직후 과정, 허혈 재관류 손상, 관련 면역 학적 메커니즘 및 확장 기준 기증자 장기의 재조정에 중점을 둔 작업 그룹에 특별한 관심을 가져야합니다.
Introduction
간 이식은 급성 또는 만성 간부전으로 이어지는 다양한 질병에서 생존 할 수있는 유일한 기회로 남아 있습니다. 1963년 Thomas E. Starzl이 인류에 처음으로 성공적으로 적용한 이후 간 이식의 개념은 주로 면역 체계에 대한 이해의 발전, 현대 면역 억제의 개발, 수술 전후 관리 및 수술 기술의 최적화의 결과로 전 세계적으로 적용되는 신뢰할 수 있는 치료 옵션으로 발전했습니다.1,2 . 그러나 인구 고령화와 장기에 대한 수요 증가로 인해 기증자 부족이 발생했으며, 확장된 기준 기증자의 한계 이식편 사용이 증가하고 지난 수십 년 동안 새로운 과제가 등장했습니다. 장기 기계 관류의 도입 및 광범위한 구현은 이식편 재조정 및 조절과 관련하여 다양한 가능성을 열어주고 장기 부족을 완화하고 대기자 명단 사망률을 줄이는 데 도움이 될 것으로 믿어집니다 3,4,5,6.
이러한 개념과 생체 내 효과를 평가하기 위해서는 번역 이식 모델이 필요합니다7. 1983 년 Kamada et al. 쥐에서 효율적인 동종 간 이식 모델을 도입했으며, 이후 전 세계 작업 그룹 8,9,10,11에 의해 광범위하게 수정되고 적용되었습니다. 마우스의 동종 간 이식 모델은 기술적으로 더 까다 롭지 만 면역 학적 전이 가능성 측면에서 더 가치가 있으며 1991 년 Qian et al.12에 의해 처음보고되었습니다. 가용성, 동물 복지 및 비용에 관한 이점에도 불구하고 설치류 모델은 임상 환경에서의 적용 가능성이 제한적입니다7. 따라서 대형 동물 모델이 필요합니다.
최근 몇 년 동안 돼지는 인간과의 해부학 적 및 생리 학적 유사성으로 인해 번역 연구에 사용되는 주요 동물 종이되었습니다. 또한, 이종 이식 분야의 현재 진전은 연구 대상13,14로서 돼지의 중요성을 더욱 증가시킬 수 있습니다.
Garnier et al. 1965 년 초 돼지의 간 이식 모델을 설명했습니다15. 1967 년 Calne et al. 1971 년 Chalstrey et al.을 포함한 여러 저자는 이후 수정을보고하여 궁극적으로 16,17,18,19,20,21을 따르는 수십 년 동안 실험용 돼지 간 이식의 안전하고 실현 가능한 개념으로 이어졌습니다.
보다 최근에, 다른 작업 그룹은 거의 예외 없이 능동 또는 수동 정맥-정맥, 즉 포르토-카발, 우회를 포함하는 돼지 동종 간 이식 기술을 사용하여 간 이식의 현재 문제와 관련된 데이터를 제공했습니다19,22. 그 이유는 비교적 큰 장과 더 적은 포르토 기병 또는 기병-기병 션트(예: 대정맥 접합 부족)로 인해 무간기 동안 대정맥 열등한 대정맥과 문맥의 클램핑에 대한 종 특이적 편협성으로 인해 수술 전후 이환율과 사망률이 증가하기 때문입니다23. 대안으로 인간 수혜자에게 적용되는 대정맥 열등한 보존 이식 기술은 열등한 돼지 대정맥이 간 조직23에 둘러싸여 있기 때문에 실현 가능하지 않습니다.
그러나 정맥-정맥 우회술을 사용하면 이미 까다로운 수술 절차에서 기술 및 물류 복잡성이 더욱 증가하여 작업 그룹이 모델 구현을 완전히 시도하지 못할 수 있습니다. 우회술의 직접적인 생리적 및 면역학적 효과 외에도 일부 저자는 션트 배치 중 출혈 또는 공기 색전증과 같은 심각한 이환율과 동시 비장 절제술의 필요성을 지적했으며, 이는 생착 후 장단기 결과에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다24,25.
다음 프로토콜은 20 시간 동안 기증자 장기의 정적 냉장 보관 후 돼지 동종 간 이식의 간단한 기술을 설명하며, 기증자 간 조달, 백 테이블 준비, 수혜자 간 절제술 및 마취 전 및 수술 중 관리를 포함하여 생착 중 정맥 정맥 우회술을 사용하지 않고 확장 된 기준 기증자 상태를 나타냅니다.
이 모델은 수술 직후 과정, 허혈 재관류 손상, 확장 기준 기증자 장기의 재조정 및 관련 면역 메커니즘에 중점을 둔 외과 작업 그룹에 특별한 관심을 가져야합니다.
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Protocol
이 연구는 니더작센 지역 소비자 보호 및 식품 안전 당국의 승인을 받은 후 하노버 의과 대학의 동물 과학 연구소에서 수행되었습니다(Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit [LAVES]; 19/3146).
1. 기증자 간 조달
참고 : 간 기증자는 4-5 개월 된 암컷 돼지 (Sus scrofa domesticus)였으며 평균 체중은 약 50kg으로 수술 전 최소 10 일 동안 동물 연구 시설에서 이미 격리되었습니다.
- 아트로핀 (0.04-0.08 mg / kg 체중), 졸라 제팜 (5 mg / kg 체중) 및 틸 레타민 (5 mg / kg 체중)의 근육 주사로 사전 투약을 수행하십시오. 정맥 내 접근 (예 : 귀 정맥)을 설정 한 후 propofol (1.5 - 2.5 mg / kg 체중)을 주사하여 마취를 유도합니다.
- 동물의 크기와 해부학에 따라 8.0-8.5 mm 기관 내 튜브로 삽관을 수행하십시오. 심전도 모니터링, 호흡 가스 및 말초 산소 포화도 측정, 비침습적 혈압 측정을 설정합니다.
- 이소 플루 란 흡입 (0.8-1.5 vol %) 및 펜타닐 정맥 내 투여 (0.003-0.007 mg / kg 체중)를 통해 기증자 간 조달 중에 돼지의 마취를 유지하십시오. 절차 전반에 걸쳐 볼륨 조절 환기를 수행하십시오.
- 기증자 돼지를 앙와위 자세로 놓고 탄성 밴드로 수술대 바닥에 팔다리를 고정시킨 후 포비돈 요오드 또는 이소 프로필 알코올과 같은 방부제로 피부를 문지르고 멸균 커튼으로 동물을 덮으십시오.
- 발가락 꼬집음에 대한 금단 반응의 손실로 적절한 마취 깊이를 확인하십시오. 단극 소작술을 사용하여 검상돌기에서 시작하는 정중선 개복술을 시행합니다. 복부 견인기를 놓고 기증자의 오른쪽으로 장을 동원하십시오.
- 비장 인대, 위 비장 인대 및 비장 비장 인대를 해부하여 비장 절제술을 시행하십시오. Overholt 클램프로 비장 정맥과 비장 동맥을 비장 힐럼 근처에 고정하고 혈관을 절단 한 후 합자 (3-0 폴리 필라멘트 봉합사)를 놓습니다. 양극성 겸자 또는 결찰로 추가 (작은) 혈관을 절단하십시오.
알림: 기증자 간 조달 중 비장 절제술은 의무 사항은 아니지만 관류 중 및 관류 후에 혈액 유출을 줄입니다. - 기증자의 왼쪽으로 장을 동원하고 가위와 양극성 소작기를 사용하여 대열 인대와 삼각형 인대를 절단하십시오.
- 간을 충분히 해부 한 후 가위를 사용하여 5-10cm의 거리에서 횡격막의 왼쪽 부분을 절개하여 하행 대동맥의 흉부 부분을 찾습니다. 조이지 않고 합자 (3-0 폴리 필라멘트 봉합사)를 둘러싸고 놓습니다.
- 가위를 사용하여 5-10cm의 거리에서 횡격막의 오른쪽 부분을 절개하고 하부 간 대정맥을 확인하십시오.
- 기증자의 왼쪽 상단으로 장을 재배치하고 가위를 사용하여 5-10cm의 거리에서 복막의 횡 절개로 후 복막 공간으로 들어갑니다.
- 장골 분기점 바로 위의 복부 대동맥과 하대 정맥을 찾아 약 6cm 길이로 두 혈관을 분리하십시오. 복부 대동맥 주위에 두 개의 3-0 폴리 필라멘트 합자를 놓습니다 : 장골 분기점의 두개골 하나와 두개골로 약 3cm 떨어진 두개골을 조이지 마십시오. 조이지 않고 열등한 간내 대정맥 주위에 다른 합자를 놓습니다.
- 정맥 주사 헤파린 (25,000 IE). 적절한 캐뉼러를 선택하고 냉각된 보존 용액으로 드립 라인을 공기를 제거하십시오.
- 복부 대동맥 주위에 꼬리에 위치한 첫 번째 합자를 조입니다. 두 번째 합자의 복부 대동맥을 두개골로 폐색 한 후 (수동으로 또는 외상성 혈관 클램프를 배치하여) 가위를 사용하여 두 합자 사이에 횡 방향 절개를하십시오.
- 캐뉼러를 절개 부위에 삽입하고 나머지 합자로 고정하십시오. 가위를 사용하여 간장 하대 정맥을 두개골 (우심방에 가까운)으로 절단하십시오.
- 약 1,500-2,000 mL의 혈액 손실 후, 합자를 묶어 하행 대동맥의 흉부 부분을 교차 고정하고 전향 관류를 시작하십시오.
참고: 생착 중 혈액(수혈)이 필요하거나 정상 체온 기계 관류가 필요할 경우 구연산염 기반 항응고제가 들어 있는 용기를 사용하여 전혈(약 1,500mL)을 수집할 수 있습니다. - 하부 대정맥 주위에 배치 된 합자를 조이고 합자의 두개골 혈관을 절개하고 수술 용 흡인기를 삽입하십시오. 치사량의 펜토바르비탈 나트륨(5,000mg)을 주사하십시오. 간 조직을 손상시키지 않고 분쇄 된 멸균 얼음을 흉강과 복강에 넣습니다.
- 약 10-15 분 동안 3,500mL의 보존 용액으로 관류 한 후, 절개 된 간장 대정맥을 절단합니다. 왼쪽 신장 정맥 수준에서 열등한 간부 대정맥을 절단하십시오.
- 담즙 유출을 피하기 위해 두 합자 (3-0 폴리 필라멘트) 사이의 췌장 조직의 담관 두개골을 절단하십시오. 췌장의 문맥 두개골을 절단하십시오.
- 무딘 준비 후 체강 동맥을 찾아 복부 대동맥으로 등쪽을 따르십시오. 나중에 생착을위한 패치를 만들기 위해 각 대동맥 부분을 절제하십시오.
- 가위를 사용하여 하부 대정맥 주변의 횡격막을 절제하고 나머지 유착을 절단하십시오. 간을 추출하십시오.
- 담낭 절제술을 시행하거나 낭성 덕트 주위의 합자를 조이고 최소 20mL의 보존 용액으로 총 담관을 세척하십시오. 관류 캐뉼라를 문맥에 넣고 500mL의 보존 용액으로 이식편을 씻어냅니다. 얼음 위에 놓인 멸균 그릇에 이식편을 넣으십시오.
참고: 과학적 목적에 따라 장기는 백테이블 준비 및 생착을 시작하기 전에 즉시 생착을 준비하거나 무기한(이 프로토콜에서는 20시간) 동안 얼음 위에 보관할 수 있습니다.
2. 간 백 테이블 준비
- 대동맥 분절에서 시작하는 림프 조직을 제거하여 클립, 합자 (4-0 폴리 필라멘트) 또는 봉합사 (5-0 모노 필라멘트; 그림 1A). 마찬가지로 문맥 주변의 림프 조직을 제거하고 봉합사 (5-0 모노 필라멘트)로 측면 가지를 폐색합니다.
- 하부 대정맥을 확인하고 주변 횡격막 조직을 제거한 후 양쪽 횡격막 정맥(5-0 모노필라멘트) 주위에 봉합사를 놓습니다. 차가운 식염수 또는 보존 용액으로 모든 용기를 씻어 남은 누출을 확인하십시오. 개별 해부학 적 상황을 고려하기 위해 생착시에만 혈관을 단축하고 대동맥 패치를 준비하십시오.
3. 수혜자 간 절제술, 기증자 간 생착 및 수술 전후 관리
참고 : 간 수혜자로는 4-5 개월 된 암컷 돼지 (Sus scrofa domesticus)와 평균 체중이 약 50kg 인 돼지가 사용되었습니다. 간 기증자와 유사하게 수혜자는 이식 전 최소 10 일 동안 동물 연구 시설에서 격리되었습니다.
- 마취 및 수술 전후 관리
- 아트로핀 (0.04-0.08 mg / kg 체중), 졸라 제팜 (5 mg / kg 체중) 및 틸 레타민 (5 mg / kg 체중)의 근육 주사로 사전 투약을 수행하십시오. 정맥 내 접근 (예 : 귀 정맥)을 설정 한 후 propofol (1.5-2.5 mg / kg 체중) 주사로 마취를 유도하십시오.
- 동물의 크기와 해부학에 따라 8.0-8.5 mm 기관 내 튜브로 삽관을 수행하십시오. 심전도 모니터링, 호흡 가스 및 말초 산소 포화도 측정, 비침습적 혈압 측정을 설정합니다. 만성 모델의 경우 외과 적 개입 후 건조를 피하기 위해 눈 연고를 바르십시오.
- 수령 동물을 앙와위 자세의 가열 받침대에 놓고 탄성 밴드로 수술대 바닥에 팔다리를 고정하십시오.
- 연장 모니터링을 위해 초음파 유도하에 3 루멘 중앙 정맥 카테터와 대 구경 정맥 카테터 (7 Fr.)를 내부 경정맥에 삽입하고 부피 치료를 위해 대 구경 정맥 카테터 (7 Fr.)를 배치합니다. 또한 침습적 혈압 측정을 위해 초음파 제어하에 동맥 카테터를 내 경동맥 / 자궁 경부 동맥에 삽입합니다 (그림 1B).
- 이소 플루 란 흡입 (0.8-1.5 부피 %) 및 펜타닐 정맥 내 투여 (0.003-0.007 mg / kg 체중)를 통해 장기 검색 중에 마취를 유지하십시오. 절차 전반에 걸쳐 볼륨 조절 환기를 수행하십시오. 수술 전후 항생제에 2,000mg의 술타 미실린과 250mg의 메틸 프레드니솔론을 정맥 주사하십시오.
- 노르에피네프린과 같은 혈압을 정맥 내 투여하여 목표 평균 동맥압 60mmHg를 달성하십시오. 또한 필요한 경우 Ringer의 젖산 용액 또는 유체 젤라틴과 같은 콜로이드 용액과 같은 결정질 용액을 적용하십시오.
- 10 분마다 얻은 혈액 가스 분석과 관련하여 글루 콘산 칼슘 (8.4 %)과 중탄산 나트륨 (8.4 %), 포도당 (40 %) 또는 염화칼륨 (7.45 %)을 정맥 주사하십시오.
- 수혜자 간 절제술
- 포비돈-요오드 또는 이소프로필 알코올과 같은 방부제로 피부를 문지르고 멸균 커튼으로 동물을 덮으십시오.
- 발가락 꼬집음에 대한 금단 반응의 손실로 적절한 마취 깊이를 확인하십시오. 단극 소작술을 사용하여 검상돌기에서 시작하는 정중선 개복술을 시행합니다. 복부 견인기를 놓고 기증자의 왼쪽으로 장을 동원하십시오. 축축한 천으로 내장을 덮으십시오.
- 수술 중 부피 관리의 최적화를 위해 치골 상 요도 카테터를 배치하십시오.
- 가위와 양극성 소작기를 사용하여 falciform 인대와 삼각형 인대를 절단하십시오. 간을 충분히 해부 한 후, 간 실질에 가까운 열등한 간상 및 하부 대정맥을 둘러 쌉니다.
- 두 합자 사이의 낭성 덕트 접합부 아래의 총 담관을 해부하고 절단합니다 (3-0 폴리 필라멘트).
- 간 십이지장 인대를 덮고있는 표재성 복막층을 절개하고 간 실질에 들어가기 직전에 간동맥을 확인하십시오. 양극성 소작 또는 클립, 합자 또는 봉합사의 배치를 사용하여 해부합니다.
- 오른쪽 및 왼쪽 횡격막 근육의 정중선 (무 혈관 층)을 절개로 복부 대동맥을 해부하십시오. 주변 조직을 제거하여 대동맥 문합을 위해 대동맥을 준비하십시오.
참고: 이 단계는 대동맥 문합을 수행하는 경우에만 필요합니다. 그렇지 않으면 간동맥/힐라 부위를 추가로 해부하여 기증자와 수혜자 간동맥 사이의 종단 간 문합을 준비합니다. - 문맥에 무 외상성 혈관 클램프를 배치 한 다음 하부 간 대정맥 (꼬리로 간을 수축시키는 동안 주변 횡격막 포함)과 하부 간 대정맥에 외상성 혈관 클램프를 배치하여 수혜자 간 절제술을 수행합니다.
- 간 실질에 가까운 세 개의 혈관을 모두 절단하십시오. 복강에서 수령인 간을 제거하십시오.
알림: 혈관의 클램핑은 무간 단계의 시작을 표시합니다. 무간기 동안 돼지는 혈역학 적으로 불안정하며 적절한 양의 혈압 강하제 / 카테콜아민이 필요합니다. 마취과 의사는 노르 에피네프린과 에피네프린을 적용 할 준비가되어 있어야합니다. 간장의 재관류 때까지 가능한 한 짧게 유지하십시오. 마취과 의사와 잘 의사 소통하십시오.
- 기증자 간 생착
- 기증자 간을 복강에 넣으십시오. 기증자 및/또는 수혜자 문합에 꼬임이나 너무 많은 긴장을 피하면서 적절한 길이보다 열등한 간상 대정맥을 줄입니다.
- 단일 봉합사를지지 실 (5-0 모노 필라멘트)로 배치하여 기증자와 수혜자 간 상 대정맥의 오른쪽 모서리를 열등하게 조정합니다. 혈관의 왼쪽 모서리에서 문합의 등쪽을 실행 봉합사 (5-0 모노 필라멘트, 양팔)로 시작합니다.
- 오른쪽 모서리에 도달하면지지 실을 제거하고 클램프로 흐르는 봉합사를 고정하고 다시 혈관의 왼쪽 모서리에서 시작하여 문합의 복부 쪽을 계속합니다. 협착을 피하기 위해 용기 직경을 수축시키지 않고 여러 매듭으로 봉합사를 조입니다.
- 기증자 및/또는 수혜자 문맥을 적절한 길이로 줄이면서 문합에 꼬임이나 너무 많은 긴장이 가해지는 것을 피하십시오.
- 6-0 모노 필라멘트, 이중 암 봉합사를 사용하여 3.3.2-3.3.3 단계와 유사한 기증자 및 수혜자 문맥의 혈관 문합을 수행하십시오.
- 혈관 클램프를 제거하고 수용자 문맥을 폐색하여 포르토 정맥 재관류를 수행하고 약 200-400mL의 혈액을 배출 한 후 혈관 클램프로 하부 기증자 간하 대정맥을 폐색합니다. 수혜자 하부 대정맥을 폐색하는 혈관 클램프를 천천히 제거하고 활성 출혈을 찾습니다.
알림: 두 클램프를 제거하면 간장의 끝이 표시됩니다. 필요한 카테콜아민의 양은 그 직후에 크게 감소해야 합니다. - 기증자 및/또는 수혜자 하부 대정맥을 열등하게 줄입니다. 5-0 모노 필라멘트, 이중 팔 봉합사를 사용하여 3.3.2-3.3.3 단계와 유사한 기증자 및 수혜자 간하부 대정맥의 혈관 문합을 수행하십시오. 기증자와 수혜자를 가리는 클램프를 제거하십시오 하부 간부 대정맥 열등한.
- 가위를 사용하여 해부학 적 상황에 따라 직경 약 1-1.5cm의 타원형 대동맥 패치 (Carrel patch)를 준비하십시오. 외상성 Cooley 혈관 클램프로 복부 대동맥을 고정하고 메스를 사용하여 절개하십시오. 패치에 맞게 가위를 사용하여 절개 부위를 확대하십시오.
- 절개/패치의 두개골 모서리에 실행 봉합사(6-0 모노필라멘트, 양팔)로 대동맥 문합을 시작합니다. 꼬리 모서리에 도달하면 클램프로 실행중인 봉합사를 고정하고 두개골 모서리에서 시작하여 문합을 다시 완료하십시오. 여러 매듭으로 봉합사를 조이고 혈관 클램프를 천천히 제거하십시오.
알림: 복부 대동맥의 클램핑은 돼지의 혈압에 큰 영향을 미칩니다. 마취과 의사와 잘 의사 소통하십시오. - 동맥 문합 주위에 지혈 거즈를 놓습니다. 총 담관에 카테터를 놓고 단일 합자로 고정하십시오. 카테터의 직경이 막히지 않도록 하십시오.
- 흐르는 봉합사로 근육근막과 피부를 조정하여 복부를 일시적으로 닫고 열 손실을 방지하기 위해 달라붙는 필름 및/또는 커튼으로 복부를 덮습니다.
참고 : 과학적 목표에 만성 모델이 필요한 경우 기증자와 수혜자 담관 사이의 종단 간 문합을 수행하고 복막과 근막에 대해 별도의 실행 봉합사로 복부를 닫고 단일 봉합사로 피부를 닫습니다. - 추적 관찰이 끝나면 수술 중 안락사를 위해 5,000mg의 펜토 바르비탈 나트륨을 치사량 주사하십시오.
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Representative Results
이 프로토콜에 제시된 기술은 수술 후 과정에서의 이식 기능뿐만 아니라 절차 전반에 걸쳐 혈역학 적 안정성과 동물 생존 측면에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 제공했습니다.
가장 최근에, 우리는 허혈 재관류 손상 및 수술 직후 과정에서 해로운 영향을 완화하는 치료 적 중재 연구에 모델을 적용했다. 회수 및 20 시간의 정적 냉장 보관시, 간 이식편 (평균 중량 983.38g)을 설명 된 방식으로 이식 하였다. 실험은 문맥-정맥 재관류 및 혈액 및 담즙, 간 및 담관 조직의 샘플링 후 6시간 후에 정의된 간격으로 종료되었습니다. 모든 수혜자는 안락사까지 전신 마취하에 생착 및 후속 6 시간 추적 관찰에서 살아 남았습니다.
이 프로토콜의 초점은 정맥 - 정맥 우회술을 사용하지 않는 돼지 동종 간 이식 모델의 타당성에 있기 때문에 여기에 제시된 결과는 수술 중 필수 매개 변수 및 혈압 강하제 적용 (그림 2)뿐만 아니라 기존의 실험실 매개 변수, 즉 젖산의 혈청 농도에 의해 정의 된 이식 성능으로 제한됩니다. 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST), 알라닌 트랜스아미나제(ALT) 및 글루타메이트 탈수소효소(GLDH), 담즙 생성(표 1) 및 돼지 간 절제술 모델에서 이전에 설명한 바와 같이 간 최대 기능 용량(LiMAx) 테스트(그림 3)26. LiMAx 테스트는 간 특이적 CYP1A2 시스템에 의해 정맥으로 주입된 13C-메타세틴의 실시간 대사를 기반으로 합니다. 주입 전후, 호기 공기 중의 13CO2 12CO2의 비율은 개인의 간 기능을 정량화하기 위해 결정된다(27).
예상대로, 수혜자는 평균 동맥압 (MAD)을 ≥60 mmHg로 안정화시키기 위해 무간기 직전과 전반에 걸쳐 노르 에피네프린 농도를 증가시켜야했습니다. 이 취약한 기간에 심 박출량을 추가로 증가시키기 위해 저농도의 에피네프린을 동시에 사용했습니다. 문맥 정맥 재관류시, 혈압 강하제의 필요성은 빠르게 감소했으며, 대동맥 문합을 완료하기 위해 복부 대동맥을 일시적으로 조이는 동안 더욱 감소했습니다. 생착 후, MAD와 필요한 용량의 혈압 강하제는 안정적으로 유지되었습니다.
피부 절개에서 모든 혈관 문합 및 재관류의 완료까지의 시간으로 정의되는 평균 수술 시간은 27.13분의 평균 무간상을 포함하여 103.50분이었다. 참고로, 2명의 수혜자만이 30분 이상의 무인 단계를 거쳤습니다. 모든 수혜자는 문맥정맥 재관류 후 4시간 후에 젖산 혈청 농도가 감소하는 것으로 나타났고, 문맥정맥 재관류 후 6시간 후에 얻은 LiMAx 값은 한 명을 제외한 모든 수혜자(34분의 무간기)에서 장기 조달 전 간 기증자에서 측정된 값과 유사했습니다.
그림 1: 이식 및 수혜자 준비. (A) 그림은 체강 축과 대동맥 세그먼트의 백 테이블 준비를 보여줍니다. (B) 이 그림은 왼쪽 내경정맥의 중심 정맥 카테터(파란색)와 오른쪽 내경동맥/경추동맥의 동맥 카테터(빨간색)를 포함하여 확장된 모니터링이 있는 앙와위 자세의 수혜자를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 생착 중에 필요한 평균 동맥압 및 혈압 강하제 농도. 이 그림은 8명의 수혜자 모두에서 시술 전반에 걸쳐 정의된 기간 동안 측정된 평균 동맥압(mmHg 단위의 MAD)과 노르에피네프린 및 에피네프린 농도(μg/kg/h)를 보여줍니다. 값은 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 간 조달 전 기증자로부터 얻은 간 최대 기능 용량 (LiMAx) 검사 값과 생착 후 6 시간 후 수혜자로부터 얻은 값. 그림은 간 조달 전 기증자의 간 최대 기능 용량 (LiMAx) 테스트와 생착 후 6 시간 (n = 8)의 수혜자로부터의 상자 그림 데이터 (평균의 평균 및 표준 오차)를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 실험 | 이식 무게 | 받는 사람 무게 | 증권 시세 표시기 | 운영 시간 | 무간기 | 젖산 염 (밀리몰 / L) | 피크 AST | 피크 ALT | 피크 GLDH | 담즙 볼륨 | ||
| 아니요. | (지) | (킬로그램) | (%) | (분) | (분) | 2시간 | 4시간 | 6시간 | (미국) | (미국) | (미국) | (밀리리터) |
| 1 | 1082 | 48.8 | 2.22 | 115 | 25 | 5.8 | 4.7 | 3.7 | 677 | 122 | 39 | 48 |
| 2 | 946 | 51.4 | 1.84 | 125 | 34 | 6.6 | 5.9 | 5.2 | 1207 | 109 | 268 | 15 |
| 3 | 957 | 57.6 | 1.66 | 110 | 30 | 8.3 | 5.8 | 8.1 | 742 | 125 | 143 | 73 |
| 4 | 825 | 49.2 | 1.68 | 87 | 22 | 7.6 | 6.7 | 6.5 | 675 | 99 | 113 | 35 |
| 5 | 1045 | 53.4 | 1.96 | 101 | 25 | 7.9 | 6.8 | 5.6 | 919 | 86 | 129 | 25 |
| 6 | 924 | 45.2 | 2.04 | 105 | 32 | 6.7 | 4.6 | 3.7 | 414 | 90 | 114 | 75 |
| 7 | 785 | 48.2 | 1.63 | 95 | 24 | 6.8 | 4.8 | 4.1 | 557 | 70 | 110 | 1.5 |
| 8 | 1303 | 54.6 | 2.39 | 90 | 25 | 12.7 | 12.2 | 9.8 | 1011 | 87 | 94 | 10 |
| 의미하다 | 983.38 | 51.05 | 1.93 | 103.50 | 27.13 | 7.80 | 6.44 | 5.84 | 775.25 | 98.50 | 126.25 | 35.31 |
| 증권 시세 표시기 | 57.59 | 1.41 | 0.10 | 4.57 | 1.52 | 0.76 | 0.88 | 0.78 | 90.79 | 6.73 | 23.00 | 9.87 |
표 1: 수술 전후 이식편 및 수용자 변수. 이 표는 이식편 및 수혜자 체중뿐만 아니라 이식편 대 수혜자 중량비 (GRWR) 및 수술 기간 (피부 절개에서 모든 혈관 문합 및 재관류 완료까지) 및 무간기를 요약합니다. 통상적인 실험실 파라미터, 즉 락테이트, 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST), 알라닌 트랜스아미나제(ALT) 및 글루타메이트 탈수소효소(GLDH)의 혈청 농도, 및 담즙 생산과 같은 이식 기능을 나타내는 변수가 수행된 8개의 이식 각각에 대해 제공됩니다.
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Discussion
기계 관류의 도입과 같은 최근의 기술 개발은 간 이식 분야에 혁명을 일으킬 잠재력을 가지고 있습니다. 이식편 재조정 또는 변형 개념을 임상 환경으로 변환하기 위해서는 대형 동물에서 재현 가능한 이식 모델이 불가피합니다.
돼지 동종 간 이식의 초기 도입 이후, 몇몇 저자는 지난 5 년 동안 이러한 기술의 개선을 위해 노력해 왔습니다. 보고된 외과적 접근 방식의 차이는 종종 경미하며 혈관 및 담즙 문합, 마취 및 수술 전후 관리와 관련이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 정맥 - 정맥 바이 패스의 사용이 여전히 일반적이지만 선택 사항인 임상 간 이식의 현재 상황과는 달리, 28, 돼지의 무간기 동안 능동 또는 수동 포르토 - 기병 바이 패스는 장 혼잡을 줄이기위한 필요성으로 간주되며, 따라서 혈역학 적 불안정성 및 수술 전후 사망률을 동반 한 후속 장 허혈, Esmaeilzadeh et al.25의 잘 짜여진 작업에 설명 된대로.
카테터, 펌프 장치, 추가 항응고의 필요성, 공기 색전증 또는 출혈과 같은 잠재적인 합병증과 같은 정맥-정맥 우회술의 수반되는 추가 비용 및 기술적 문제 외에도 선택한 접근 방식에 따라 동시 비장 절제술의 필요성으로 인해 그룹은 정맥-정맥 우회술 없이 수정된 기술을 설명하게 되었습니다.25,29, 30.
Torres et al.31은 수동 포르토 기병 션트를 가진 수혜자와 비교하여 정맥-정맥 우회술을 사용하지 않고 생착을 받는 동물에서 심각한 혈역학적 불안정성을 관찰했으며, 따라서 이 동물에서 대동맥 상부 클램핑을 일시적으로 수행했으며, 이는 돼지 간 자동/동종 이식 모델에서 다른 사람들도 설명했습니다. 23,31,32 . 그러나, 수용자 대동맥의 교차 클램핑에 의한 온열 허혈의 유도는 재관류시 전 염증성 분자 및 조직 손상의 관련 방출의 위험을 지니고, 따라서, 특히 허혈 - 재관류 손상을 평가할 때 신뢰할 수있는 과학적 결과를 생성하기 위해 어떤 대가를 치르더라도 피해야한다. 또한,이 접근법은 인간의 임상 실습과 유사하지 않으므로 이러한 모델에서 얻은 결과의 번역을 제한합니다.
이러한 해로운 지원 조치를 피하기 위해서는 두 가지 사항이 중요하다고 생각합니다. (1) 무간기는 Battersby et al.33에 의해 돼지 간 이식의 초기 단계에서 이미 보여진 것처럼 절대 최소, 즉 30 분 미만으로 유지되어야합니다. 우리는 봉합사 (이중 팔)와 최대의지지 실이 하부 간 대정맥과 문맥 모두에 대해 간단하고 안전한 문합을 만들기에 충분하다고 믿습니다. 분명히, 문맥-정맥 재관류는 하부 대정맥을 문합하기 전에 시작되어야합니다. (2) 마취 관리는 인간 환자의 간 수술 또는 이식에 이상적으로 익숙한 숙련 된 마취과 의사가 수행해야합니다34. 단순화 된 수술 기술과 함께 혈압 강하제, 즉 노르 에피네프린과 에피네프린을 사용한 정교한 볼륨 관리 및 치료는이 모델의 성공적인 구현을위한 기초입니다.
흥미롭게도, 소수의 수술 그룹 만이 정맥 - 정맥 우회술과 수반되는 상부 대동맥 클램핑없이 성공적인 돼지 동종 간 이식에 대한 데이터를 제공했습니다. 우리가 아는 한 Oike et al., Heuer et al., 그리고 가장 최근에는 Fondevila et al.이 생존율이 각각87%, 80% 및 100%로 35,36,37%로 (유망한) 결과를 보고한 유일한 그룹이었습니다. 우리 코호트의 중간 무인 시간은 25분이었고 따라서 Heuer et al.36이 제시한 데이터와 동일했습니다. 무인 단계에서 Oike et al.35는이 코호트에서 관찰 된 것과 유사하게 동맥 혈압이 50 % -60 % 감소했다고보고했으며, 이로 인해 MAD가 60mmHg 미만으로 감소하는 것을 피하기 위해 혈압 강하제의 복용량이 증가했습니다. Heuer et al.36은 간행물에서 카테콜아민 요법의 사용에 대해 언급하지 않았지만 혈역학적 안정성을 개선하기 위한 전혈의 수혈에 대해서는 구체적으로 언급하지 않았습니다. 이 모델에서는 후자가 필요하지 않았습니다. 평균 무인 시간이 20분 미만이라고 보고한 Fondevila 등은 결정질 용액의 투여에만 의존했으며 생착37 동안 혈관 활성 물질을 적용하지 않았습니다.
참고로, 기증자로부터 수혜자 간동맥19,22로 종단 간 문합을 적용하는 최근 간행물과는 달리,이 모델은 기증자 대동맥의 카렐 패치가 수혜자의 상부 대동맥에 문합되는 종단 간 문합을 포함합니다. 특히 실험 환경의 경우 연장된 기증자 기준을 충족하는 장기를 사용하는 경우(예: 장기간의 저온 허혈 시간) 이식편의 동맥 관류 문제를 배제하는 것이 유리할 수 있습니다. Carrel 패치를 적용하면 재관류 후 자주 관찰되는 수반되는 말초 혈관 경련의 경우 기능적으로 관련될 수 있는 동맥 문합의 협착을 방지하는 데 도움이 됩니다. 그럼에도 불구하고, 이 접근법은 대동맥의 보다 정교한 접근으로 인해 기존의 종단 간 문합보다 시간이 더 많이 소요될 것입니다.
우리의 대표적인 실험이 수술 직후 단계와 허혈 재관류 손상에 초점을 맞추었기 때문에 수혜자는 마취 상태로 유지되었고 재관류 후 6시간 후에 안락사되었습니다. 동물 복지와 관련하여 유익하지만, 이는 이식 및 수혜자 생존에 관한 우리 기술의 검증에 상당한 제한을 구성합니다. 그러나 우리는 중요한 매개 변수, 혈역학, 젖산 제거율, 담즙 생성, 특히 추적 관찰 전반에 걸쳐 관찰 된 실시간 간 특이 적 CYP1A2 대사 (LiMAx 테스트)를 기반으로 우리 모델의 장기적인 적용이 가능해야한다고 믿습니다., 특히 실험에 사용 된 이식편은 다른 사람들이 비교 가능한 이식 모델을 성공적으로 적용한 것과는 대조적으로 20 시간 전에 생착 된 정적 냉장 보관을 거쳤습니다35, 36,37. 또한, 언급 된 이전 보고서는 Oike et al.35의 연구에서 수술 후 첫 날에 폐색전증으로 사망 한 한 명의 수혜자를 제외하고는 수술 중 및 수술 후 최대 6 시간까지 수술 전후 사망률이 독점적으로 관찰되었음을 입증했습니다.
이 연구에서 우리는 생착 중 정맥 - 정맥 바이 패스를 사용하지 않고 돼지 동종 간 이식에 대한 단순화 된 접근법이 안전하게 수행 될 수 있으며 기증자 장기의 장기간 정적 냉장 보관 후에도 상당한 혈역학 적 변화 또는 수술 중 사망률없이 더 비용 효율적임을 입증합니다. 이러한 모델은 수술 직후 과정, 허혈-재관류 손상, 확장된 기준 기증자 장기의 재조정 및 관련 면역학적 메커니즘에 중점을 둔 (외과적) 작업 그룹에 특별한 관심을 가져야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 Britta Trautewig, Corinna Löbbert, Astrid Dinkel 및 Ingrid Meder의 근면과 헌신에 감사드립니다. 또한 저자는 그림 자료를 제작한 Tom Figiel에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Abdominal retractor | No Company Name available | No Catalog Number available | |
| Aortic clamp, straight | Firma Martin | No Catalog Number available | |
| Arterial Blood Sampler Aspirator (safePICOAspirator) 1.5 mL | Radiometer Medical ApS | 956-622 | |
| Atropine (Atropinsulfat 0.5 mg/1 mL) | B.Braun | 648037 | |
| Backhaus clamp | Bernshausen | BF432 | |
| Bipolar forceps, 23 cm | SUTTER | 780222 SG | |
| Bowl 5 L, 6 L, 9 L | Chiru-Instrumente | 35-114327 | |
| Braunol Braunoderm | B.Braun | 3881059 | |
| Bulldog clamp | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Button canula | Krauth + Timmermann GmbH | 1464LL1B | |
| Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL (10%)) | B.Braun | 2353745 | |
| Cell Saver (Autotransfusion Reservoir) | Fresenius Kabi AG | 9108471 | |
| Central venous catheter 7Fr., 3 Lumina, 30 cm 0.81 mm | Arrow | AD-24703 | |
| Clamp | INOX | B-17845 / BH110 / B-481 | |
| Clamp | Aesculap | AN909R | |
| Clamp, 260 mm | Fehling Instruments GMbH &Co.KG | ZAU-2 | |
| Clip Forceps, medium | Ethicon | LC207 | |
| Clip forceps, small | Ethicon | LC107 | |
| CPDA-1 solution | Fresenius Kabi AG | 41SD09AA00 | |
| Custodiol (Histidin-Tryptophan-Ketogluterat-Solution) | Dr.Franz Köhler Chemie GmbH | 2125921 | |
| Dissecting scissors | LAWTON 05-0641 | No Catalog Number available | |
| Dissecting scissors, 180 mm | Metzenbaum | BC606R | |
| Endotracheal tube 8.0 mm | Covetrus | 800764 | |
| Epinephrine (Adrenalin 1:1000) | InfectoPharm | 9508734 | |
| Falcon Tubes 50ml | Greiner | 227 261 L | |
| Femoralis clamp | Ulrich | No Catalog Number available | |
| Fentanyl 0.1mg | PanPharma | 00483 | |
| Forceps, anatomical | Martin | 12-100-20 | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD052R | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD032R | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD240R | |
| Forceps, surgical | Bernshausen | BD 671 | |
| Forceps, surgical | INOX | B-1357 | |
| G40 solution | Serag Wiessner | 10755AAF | |
| Gelafundin ISO solution 40 mg/mL | B. Braun | 210257641 | |
| Guidewire with marker | Arrow | 14F21E0236 | |
| Haemostatic gauze ("Tabotamp" 5 x 7.5 cm) | Ethicon | 474273 | |
| Heparin sodium 25,000IE | Ratiopharm | W08208A | |
| Hico-Aquatherm 60 | Hospitalwerk | No Catalog Number available | |
| Infusion Set Intrafix | B.Braun | 4062981 L | |
| Intrafix SafeSet 180 cm | B.Braun | 4063000 | |
| Introcan Safety, 18 G | B.Braun | 4251679-01 | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-bore venous catheter, 7Fr. | Edwards Lifesciences | I301F7 | |
| Ligaclip, medium | Ethicon | LT200 | |
| Ligaclip, small | Ethicon | LT100 | |
| Material scissors | Martin | 11-285-23 | |
| Methylprednisolone (Urbason solubile forte 250 mg) | Sanofi | 7823704 | |
| Monopolar ERBE ICC 300 | Fa. Erbe | No Catalog Number available | |
| NaCl solution (0.9%) | Baxter | 1533 | |
| Needle holder | Aesculap | BM36 | |
| Needle holder | Aesculap | BM035R | |
| Needle holder | Aesculap | BM 67 | |
| Neutral electrode | Erbe Elektromedizin GmbH Tübingen | 21191 - 060 | |
| Norepinephrine (Sinora) | Sintetica GmbH | 04150124745717 | |
| Omniflush Sterile Filed 10 mL | B.Braun | 3133335 | |
| Original Perfusorline 300 cm | B.Braun | 21E26E8SM3 | |
| Overhold clamp | INOX | BH 959 | |
| Overhold clamp | Ulrich | CL 2911 | |
| Pentobarbital sodium(Release 500 mg/mL) | WDT, Garbsen | 21217 | |
| Perfusers | B.Braun | 49-020-031 | |
| Perfusor Syringe 50 mL | B.Braun | 8728810F | |
| Petri dishes 92 x 17 mm | Nunc | 150350 | |
| Poole Suction Instrument Argyle flexibel | Covidien, Mansfield USA | 20C150FHX | |
| Potassium chloride (7.45%) | B.Braun | 4030539078276 | |
| Pressure measurement set | Codan pvb Medical GmbH | 957179 | |
| Propofol (1%) | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| S-Monovette 2.6 mL K3E | Sarstedt | 04.1901 | |
| S-Monovette 2.9 mL 9NC | Sarstedt | 04.1902 | |
| S-Monovette 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 11602 | |
| Sartinski clamp | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Scalpel No.11 | Feather Safety Razor Co.LTD | 02.001.40.011 | |
| Scissors | INOX | BC 746 | |
| Seldinger Arterial catheter | Arrow | SAC-00520 | |
| Sodium bicarbonate (8.4%) | B.Braun | 212768082 | |
| Sterilization Set ("ProSet Preparation Kit CVC") | B.Braun | 4899719 | |
| Sterofundin ISO solution | B.Braun | No Catalog Number available | |
| Suction | Dahlhausen | 07.068.25.301 | |
| Suction Aesculap Securat 80 | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Suction catheter | ConvaTec | 5365049 | |
| Sultamicillin (Unacid: 2000 mg Ampicillin/1000 mg Sulbactam) | Pfizer | DL253102 | |
| Suprapubic urinary catheter, "bronchialis", 50 cm | ConvaTec | UK 1F02772 | |
| Suprasorb ("Toptex lite RK") | Lohmann & Rauscher | 31654 | |
| Suture Vicryl 3-0 | Ethicon | VCP 1218 H | |
| Suture Vicryl 4-0 | Ethicon | V392H | |
| Suture, Prolene 4-0 | Ethicon | 7588 H | |
| Suture, Prolene 5-0, double armed | Ethicon | 8890 H | |
| Suture, Prolene 5-0, single armed | Ethicon | 8720 H | |
| Suture, Prolene 6-0, double armed | Ethicon | 7230 H | |
| Suture, Prolene 6-0, single armed | Ethicon | EH 7406 H | |
| Suture, Prolene: blau 3-0 | Ethicon | EH 7499H | |
| Suture, Safil 2/0 | Aesculap | C 1038446 | |
| Suture, Terylene 0 | Serag Wiessner | 353784 | |
| Syringe 2 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL | B.Braun | 4606027V | |
| TransferSet "1D/X-double" steril 330 cm | Fresenius Kabi AG | 2877101 | |
| Ultrasound Butterfly IQ+ | Butterfly Network Inc. | 850-20014 | |
| Ventilator "Oxylog Dräger Fl" | Dräger Medical AG | No Catalog Number available | |
| Yankauer Suction | Medline | RA19GMD | |
| Zoletil 100 mg/mL (50 mg Zolazepam, 50 mg tiletamin) | Virbac | 794-861794861 |
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