Summary
Het huidige protocol beschrijft zygote micro-injectie van CRISPR-Cas9 en donor-DNA om efficiënt gencassette knock-in en floxed muizen te produceren.
Abstract
CRISPR-Cas-technologie heeft de snelle en moeiteloze generatie van genetisch gemodificeerde muizen mogelijk gemaakt. In het bijzonder worden muizen en puntmutante muizen gemakkelijk geproduceerd door elektroporatie van CRISPR-factoren (en enkelstrengs oligo-DNA-donoren) in de zygote. Daarentegen worden gencassette (>1 kb) knock-in en floxed muizen voornamelijk gegenereerd door micro-injectie van CRISPR-factoren en dubbelstrengs DNA-donoren in zygoten. Genoombewerkingstechnologieën hebben ook de flexibiliteit van de productie van genetisch gemodificeerde muizen vergroot. Het is nu mogelijk om de beoogde mutaties in de doelgenomische regio's te introduceren in een aantal gunstige inteeltstammen van muizen. Ons team heeft meer dan 200 gencassette knock-in muislijnen geproduceerd, en meer dan 110 floxed muislijnen door zygote microinjectie van CRISPR-Cas9 na verzoeken van verschillende landen, waaronder Japan. Sommige van deze genoombewerking gebruikten BALB / c, C3H / HeJ en C57BL / 6N inteeltstammen, maar de meeste gebruikten C57BL / 6J. In tegenstelling tot de elektroporatiemethode is genoombewerking door zygote micro-injectie in verschillende inteeltstammen van muizen niet zo eenvoudig. Gencassette knock-in en floxed muizen op enkele inteelt genetische achtergronden zijn echter net zo kritisch als genetisch gehumaniseerde, fluorescerende reporter en voorwaardelijke knock-out muismodellen. Daarom presenteert dit artikel het protocol voor de zygote micro-injectie van CRISPR-factoren en dubbelstrengs DNA-donoren in C57BL / 6J-muizen voor het genereren van gencassette knock-in en floxed muizen. Dit artikel richt zich uitsluitend op nucleaire injectie in plaats van cytoplasmatische injectie. Naast zygote micro-injectie schetsen we de tijdlijn voor het productieproces en perifere technieken zoals inductie van superovulatie en embryotransfer.
Introduction
Knock-in muizen, waarbij de beoogde exogene genen worden geïntroduceerd op de doelloci, worden veel gebruikt in veel in vivo studies als gengehumaniseerde muizen, fluorescerende reportermuizen en Cre driver-muizen 1,2. Wanneer knock-in mutaties worden geïnduceerd door genoombewerking in muiszygoten, wordt enkelstrengs DNA (enkelstrengs oligo-DNA-donoren, ssODN) of dubbelstrengs DNA (dsDNA) gebruikt als donor-DNA 2,3. ssODN wordt voornamelijk gebruikt om relatief korte genfragmenten van minder dan 200 bp4 in te kloppen. Het is mogelijk om fragmenten langer dan 1 kb DNA in te kloppen met behulp van lange ssODN's (lsODN)5,6, maar hun voorbereiding is tijdrovend. Wanneer dsDNA-donoren worden gebruikt, kunnen gencassette (>1 kb) knock-in muizen worden gegenereerd zonder moeizame donor-DNA-voorbereiding7.
Het belangrijkste voordeel van het gebruik van ssODN's is dat elektroporatie8 knock-in muizen kan genereren. DsDNA-donoren moeten echter rechtstreeks in de kern worden ingebracht door middel van zygote micro-injectie. Gelijktijdige knock-in op twee locaties is vereist om floxed muizen te creëren, waarbij elke loxP-sequentie stroomopwaarts en stroomafwaarts van het doelgen wordt ingeklopt. Er zijn twee manieren om floxed muizen te genereren door genoombewerking in muis zygoten - met behulp van twee onafhankelijke ssODNs, elk met een enkele loxP-site, of met behulp van een enkele dsDNA (of lsDNA) met een floxed sequentie; De eerste is zeer inefficiënt 9,10,11. Genoombewerking met behulp van dsDNA-donoren is de eenvoudigste aanpak om gencassette knock-in en floxed muizen te produceren als de omgeving bevorderlijk is voor zygote micro-injectie.
In eerste instantie worden mengsels van Cas9-mRNA en sgRNA of DNA-vectoren die coderen voor sgRNA en Cas9 gebruikt voor genoombewerking in muiszygoten12,13. Omdat hoogwaardige en stabiele Cas9-eiwitten nu tegen lage kosten beschikbaar zijn, is de introductie van crRNA-tracrRNA-Cas9 ribonucleoproteïne (RNP) in muiszygoten14 populair geworden. Onlangs zijn knock-in muizen met hoge efficiëntie gegenereerd door het introduceren van het crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP en donor-DNA in beide pronuclei van muis zygoten in een celcyclusfase waar knock-in het meest waarschijnlijk is15. Daarom beschrijft het huidige protocol technieken voor het produceren van verschillende soorten knock-in muizen door deze methode.
Er zijn veel nuttige inteeltstammen van laboratoriummuizen16. Genetische modificatie binnen de inteeltachtergrond kan de invloed van genetische achtergrond op het fenotype buiten beschouwing laten. Dit artikel beschrijft een methode voor het induceren van gencassette knock-in en floxed mutaties in de zygote van de meest gebruikte inteelt muizenlijn, de C57BL/6J17. Verder worden ook de tijdlijn voor het genereren van genetisch gemodificeerde muizen en de gebruikte perifere technieken besproken, waaronder de inductie van superovulatie en embryotransfer.
Protocol
Alle dierproeven werden humaan uitgevoerd met goedkeuring van de Institutionele Dierproefcommissie van de Universiteit van Tsukuba, volgens de Voorschriften voor Dierproeven van de Universiteit van Tsukuba en de Fundamentele Richtlijnen voor Goed Verloop van Dierproeven en aanverwante Activiteiten in Academische Onderzoeksinstellingen onder de jurisdictie van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan. C57BL/6J muizen van beide geslachten, 10-25 weken oud, werden gebruikt als de zygote donor. ICR-muizen (ouder dan 10 weken) werden gebruikt als de ontvangende muizen. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen).
1. Bevestiging van crRNA-splitsingsactiviteit in een celvrij systeem
- Los 2 nmol crRNA (droog) en 20 nmol tracrRNA (droog) op in respectievelijk 25 μL en 250 μL RNasevrij water (zie tabel met materialen).
OPMERKING: CRISPR-doelsequenties waarvan werd voorspeld dat ze een hoge splitsingsactiviteit hadden en zo min mogelijk off-targets, worden geselecteerd met CRISPOR (zie Materiaaltabel). In het geval van een gencassette knock-in, richt u de sequentie op de inbrengplaats. De te floxen exon(en) werden geselecteerd met behulp van de KOnezumi (zie Materiaaltabel). - Amplificeer het DNA-fragment (ongeveer 0,5-1 kb) dat de doellocatie bevat met genomische PCR9. Zuiver dit PCR-amplicon met de gebruikelijke PCR-productextractiekit (zie materiaaltabel).
- Bereid 10 μL CRISPR-mengsel (100 ng/μL crRNA, 150 ng/μL tracrRNA en 1 ng/μL Cas9 in de Cas9 Nuclease-reactiebuffer, zie Tabel met materialen). Om het CRISPR-Cas9-complex te construeren, plaatst u het CRISPR-mengsel gedurende 30 minuten in een warmteblok bij 37 °C.
- Voeg het totale volume (10 μL) CRISPR-mengsel toe aan het PCR-product (10 μL, 20 ng/μL) zoals beschreven in stap 1.2 en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. Voeg 1 μL RNase (500 ng/μL) toe om het crRNA en tracrRNA gedurende 30 minuten bij 37 °C af te breken, aangezien RNA's afwezig moeten zijn tijdens elektroforese. Voer elektroforese uit van de bovenstaande monsters met behulp van een ladingskleurstof die natriumdodecylsulfaat bevat (2% w / v).
OPMERKING: In zeldzame gevallen worden crRNA's zonder splitsingsactiviteit waargenomen. In dergelijke gevallen wordt aanbevolen om het ontwerp voor genoombewerking opnieuw te ontwerpen.
2. Bereiding van het mengsel van crRNA, tracrRNA, Cas9-eiwit en donor-DNA voor zygote micro-injectie
- Bereid CRISPR-oplossing (50 ng/μL crRNA, 200 ng/μL tracrRNA en 200 ng/μL Cas9 in RNase-vrij water). Bereid een donor-DNA-oplossing (20 ng/μl zelfgeconstrueerde plasmide-DNA-vector).
- Filter de donor-DNA-oplossing door een steriele spuitfilter met een poriegrootte van 0,22 μm. Meng gelijke volumes CRISPR-oplossing en gefilterde donor-DNA-oplossing. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van elk 25 ng/μl crRNA, 100 ng/μl tracrRNA, 100 ng/μl Cas9 en 10 ng/μl donor-DNA is. Dit mengsel wordt hierna RNPD genoemd.
OPMERKING: Bij het snijden van twee locaties, zoals tijdens de productie van floxed muizen, moet de concentratie van elk crRNA 25 ng / μL zijn. Het donor-DNA is een circulair plasmide-DNA en kan worden gezuiverd met een gewone mini-prep spin column kit (zie Tabel van Materialen). De bereide oplossing moet zo snel mogelijk op ijs worden geplaatst en voor micro-injectie worden gebruikt.
- Filter de donor-DNA-oplossing door een steriele spuitfilter met een poriegrootte van 0,22 μm. Meng gelijke volumes CRISPR-oplossing en gefilterde donor-DNA-oplossing. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van elk 25 ng/μl crRNA, 100 ng/μl tracrRNA, 100 ng/μl Cas9 en 10 ng/μl donor-DNA is. Dit mengsel wordt hierna RNPD genoemd.
3. Het verkrijgen van muizen zygoten door natuurlijke paring
- Injecteer 5 IE serumgonadotrofine (PMSG, zie tabel met materialen) subcutaan in C57BL/6J vrouwelijke muizen (10-25 weken oud) 3 dagen vóór micro-injectie. Dien ongeveer 46-48 uur later 5 IE humaan choriongonadotrofine (hCG, zie tabel met materialen) intraperitoneaal toe. Combineer de PMSG- en hCG-behandelde vrouwelijke muizen met mannelijke C57BL/6J-muizen en controleer de vaginale pluggen de volgende ochtend.
OPMERKING: Ongeveer 15-25 zygoten kunnen worden verkregen van één vrouwelijke C57BL / 6J-muis. De tijdlijn is weergegeven in figuur 1. - Bereid twee petrischalen van 35 mm voor de zygotecultuur, zoals weergegeven in figuur 2. Plaats ze in de incubator (37 °C, 5% CO2) voor gebruik. Deze kunnen 's nachts worden opgeslagen.
- Euthanaseer de vrouwelijke muizen met bevestigde vaginale pluggen door cervicale dislocatie en snijd met een kleine schaar door de buikhuid en spierlaag vanaf de middellijn van de onderbuik tot onder de ribben.
OPMERKING: Volg de aanbevelingen van de lokale ethische commissie voor dieren voor euthanasie. - Verzamel de eileiders en plaats ze in een druppel M2-medium van 20 μL met 0,75 mg/ml hyaluronidase (zie materiaaltabel) op het deksel van de petrischaal. Pak een eileider met een fijne punttang en perfuseer ongeveer 50 μL M2 medium met hyaluronidase door de fimbriae.
OPMERKING: Op dit moment zijn de zygoten losjes omgeven door talrijke cumuluscellen. - Pak na 30 s morfologisch normale zygoten op met een kleine hoeveelheid medium met behulp van een glazen capillair en was ze door ze over te brengen naar verse M16 middelgrote druppels. Breng de gewassen zygoten over in een petrischaaltje (figuur 2) om te poolen.
OPMERKING: De tijdlijn wordt weergegeven in figuur 1. Morfologisch normale zygoten hebben een mannelijke en vrouwelijke pronucleus en twee polaire lichamen die de bolvorm niet ernstig hebben aangetast15. De morfologie van de zygote varieert aanzienlijk tussen stammen en soorten. - Herhaal stap 3.3 en 3.4 totdat alle zygoten zijn opgehaald. Ongeveer 100 zygoten kunnen worden samengevoegd in één M16-druppel in de kweekschaal. Bewaar de schaal in de couveuse (37 °C, 5% CO2) tot micro-injectie.
4. Bereiding van de micro-injectienaald
- Trek aan enkele glazen pipetten met behulp van de programmeerbare pipettrekker (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Microinjectienaalden moeten een dunne punt en lange taps toelopende naalden hebben. Als de trekker een programma heeft voor het maken van naalden voor intracytoplasmatische sperma-injectie, kan hetzelfde programma worden gebruikt om naalden voor micro-injectie te maken. - Breek de punt van de microinjectienaald door op de glazen bol te slaan die aan de microsmederijpunt is bevestigd. Zorg ervoor dat de tipgrootte van de micro-injectienaald ongeveer 1 μm in diameter is. Controleer de tipgrootte onder een microscoop bij 1000x vergroting.
- Buig de microinjectienaald op ongeveer 2-3 mm van de punt met behulp van een microforge.
OPMERKING: De hoek van de bocht is afhankelijk van de opstelling van de micromanipulator. Te veel buigen zal de effectiviteit van de piëzopuls verminderen.
5. Zygote micro-injectie
- Injecteer 1-1,5 cm van de operatievloeistof (traagheidslichaam dat nodig is voor het piëzo-effect om gaten te maken als alternatief voor kwik, zie Tabel met materialen) in het midden van de microinjectienaald en bevestig deze aan de handmatige micro-injectorhouder met de piëzo-actuator.
- Bevestig verder de houdnaald aan de tegenoverliggende handmatige micro-injectorhouder. Verplaats de operatievloeistof met geleidelijke druk naar de punt van de microinjectienaald. Bevestig beide handmatige micro-injectorhouders op de micromanipulator.
OPMERKING: De operatievloeistof die uit de punt van de microinjectienaald komt, kan onder een microscoop worden waargenomen bij een vergroting van 50x. Na het aanpassen van de hoeveelheid uitgestoten vloeistof, kan het spatten van vloeistof worden waargenomen wanneer de piëzopulsen worden toegepast, wat bevestigt dat de piëzopulsen effectief zijn. Als dit niet kan worden bevestigd, bereidt u de microinjectienaald opnieuw voor.
- Bevestig verder de houdnaald aan de tegenoverliggende handmatige micro-injectorhouder. Verplaats de operatievloeistof met geleidelijke druk naar de punt van de microinjectienaald. Bevestig beide handmatige micro-injectorhouders op de micromanipulator.
- Bereid een injectiekamer met drie druppels: (1) 10 μL M2-medium; (2) 5 μl 12% polyvinylpyrrolidon (PVP) in M2-medium; en (3) een mengsel van 5 μL van crRNA, tracrRNA, Cas9-eiwit en de donor-DNA (RNPD) oplossing. Bedek de druppels met minerale olie op dezelfde manier als stap 3.2 en zet de injectiekamer op het omgekeerde microscoopstadium.
- Laat onder de omgekeerde microscoop bij een vergroting van 50x de micro-injectiepipet in de 12% PVP-druppel zakken. Zuig en doseer 12% PVP om de binnenkant van de micro-injectienaaldpunt te reinigen en over te brengen naar de RNPD-druppel.
- Plaats de handmatige micro-injector onder negatieve druk en zuig de RNPD-oplossing op in de microinjectienaald. Wacht een paar minuten totdat er voldoende volume is aangezogen; Vul onder een microscoop die 50x is vergroot de hele binnenkant van de microinjectienaald met vloeistof.
- Stop de inname en laat de RNPD-oplossing geleidelijk worden verdreven door de handmatige micro-injector op positieve druk in te stellen. Beweeg de punt van de microinjectienaald in de olie.
OPMERKING: Draai de knop van de handmatige micro-injector tegen de klok in voor inhalatie. Om de inademing te stoppen, draait u de knop met de klok mee en verhoogt u geleidelijk de druk terwijl u onder een microscoop observeert. De RNPD-oplossing zal geleidelijk worden afgevoerd. Beweging van het vloeistofniveau in de micro-injectienaald maakt bevestiging van de uitstroom mogelijk.
- Stop de inname en laat de RNPD-oplossing geleidelijk worden verdreven door de handmatige micro-injector op positieve druk in te stellen. Beweeg de punt van de microinjectienaald in de olie.
- Doe 50 zygoten in de M2-druppel en laat de bevestigingspipet voorzichtig in dezelfde druppel zakken. Breng de microinjectienaald over in de M2-druppel met zygoten. Schakel over naar een 20x objectief en focus op de punt van de micro-injectiepipet.
OPMERKING: Plaats zoveel mogelijk zygoten die in 10 minuten kunnen worden geïnjecteerd. - Houd een zygote vast en concentreer je op de pronucleus door de micromanipulator te bewegen. Steek de microinjectienaald in de zygote en breng de punt dicht bij de pronucleus. Zodra de punt het pronucleusmembraan bereikt, brengt u de piëzopuls (intensiteit: 6-10, snelheid: 1) aan om te doorboren.
- Wanneer de micro-injectienaald de pronucleus doorboort, injecteert u de RNPD-oplossing en observeert u de zwelling van de pronucleus. Zodra de pronucleus volledig is opgeblazen, trekt u de naald er snel uit. Voer dezelfde procedure uit op zowel de vrouwelijke als de mannelijke pronuclei.
OPMERKING: De inflatie van de pronucleus door injectie is duidelijk te zien onder de microscoop. De mate van deze inflatie is moeilijk te verwoorden, maar kan worden bevestigd door te verwijzen naar eerdere rapporten15.
- Wanneer de micro-injectienaald de pronucleus doorboort, injecteert u de RNPD-oplossing en observeert u de zwelling van de pronucleus. Zodra de pronucleus volledig is opgeblazen, trekt u de naald er snel uit. Voer dezelfde procedure uit op zowel de vrouwelijke als de mannelijke pronuclei.
- Verplaats de geïnjecteerde zygote naar een andere locatie in de M2-druppel om de zygoten voor en na injectie te identificeren.
- Herhaal stap 5.5-5.6 totdat alle zygoten in de M2-druppel zijn geïnjecteerd. Breng na de injectie de zygoten over in een verse M16-schaal.
- Selecteer de overleefde zygoten 10 min na injectie. Verwijder de gelyseerde zygoten die door de injectie zijn beschadigd en verdeel overlevende zygoten naar elke druppel in de M16-schaal. Elke druppel moet 20-24 zygoten bevatten voor één pseudopregnant vrouwtje. Dit vermindert de tijd dat de M16-schotel wordt blootgesteld aan de omgeving buiten de couveuse tijdens de embryotransfer.
OPMERKING: Onder optimale injectieomstandigheden is de overlevingskans 90% -95%. Dit is afhankelijk van de grootte van de naaldpunt, de sterkte van de piëzopuls en de uitstroomdruk van de RNPD-oplossing.
6. Embryotransfer in de eileider
- Voor het verkrijgen van pseudopregnant muizen, paren elke vrouwelijke ICR-muis in de proestrusfase met een gevasoligeerde mannelijke ICR-muis. Controleer de stekkers de volgende dag.
OPMERKING: Ongeveer 15 pseudopregnant muizen worden verkregen uit 20 paringparen. - Dien drie soorten gemengde anesthetica (0,2 mg/kg medetomidine, 4,0 mg/kg midazolam en 2,5 mg/kg butorfanol, zie tabel met materialen) subcutaan toe aan de pseudopregnant vrouwelijke muizen. Bevestig de juiste anesthesie door een afname van de ademhalingsfrequentie en het verdwijnen van de ontwenningsreflexen van de staart en het achterste pedaal. Breng oogheelkundige zalf aan om de ogen te smeren volgens de aanbevelingen van de lokale ethische commissie voor dieren.
- Na het scheermesscheren van het dorsale gebied van de muis in buikligging en het desinfecteren van het chirurgische gebied drie keer, afwisselend tussen een scrub op basis van jodium of chloorhexidine en alcohol, snijdt u de dorsale huid ongeveer 1 cm langs de wervelkolom in met een kleine ontleedschaar.
- Verplaats de dorsale incisiewond naar één kant ventraal, snijd de spierlaag in waardoor de eierstok kan worden gezien, grijp het vet boven de eierstok met een pincet en trek de eierstok, eileider en baarmoeder terug.
- Zet het vet vast met een serrefineklem (zie Materiaaltabel). Plaats de voortplantingsweefsels op steriel gaas om direct contact met de vacht te voorkomen.
- Plaats in de volgende volgorde een kleine hoeveelheid kweekmedium (M2 of M16), enkele luchtbellen als marker en de zygoten in een pipet voor overdracht.
OPMERKING: Breng ongeveer 10-12 zygoten per eileider over. - Maak een incisie met behulp van een microschuiving (zie materiaaltabel) tussen de ampulla en de fimbriae van de eileider (net lang genoeg om de glazen pipet binnen te laten), breng de zygoten in de incisie en bevestig tegelijkertijd dat de luchtbel is ingebracht.
- Voer de implantatie in de andere eileider op dezelfde manier uit (stap 6.6).
- Hecht de buitenste huid vast met autoclips (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Hecht de ingesneden spierlaag niet tenzij de incisiewond onvermijdelijk groot is. De ideale grootte van de ingesneden spierlaag moet minder dan 2-3 mm zijn. Als de incisie groter is dan 5 mm, moet de spierlaag worden gehecht met behulp van een gesteriliseerde hechtnaald en draad (zie tabel met materialen).
7. Herstel van dieren
- Dien atipamezolhydrochloride (0,3 mg/kg) subcutaan toe aan muizen.
OPMERKING: Volg de aanbevelingen van de lokale ethische commissie voor dieren voor postoperatieve analgesie. - Plaats de muizen vervolgens in kooien en houd ze warm op een hete plaat bij 37 °C.
- Nadat de muizen zijn ontwaakt, houdt u ze ongeveer 2 uur warm. Nadat u hebt bevestigd dat er geen abnormaal gedrag van de muizen is, brengt u de kooien terug naar het kweekrek.
Representative Results
De productieresultaten van gencassette knock-in en floxed muizen met behulp van dit protocol zijn weergegeven in tabel 1 en tabel 2. De doelgenen werden niet vermeld omdat elke genoom-bewerkte muislijn momenteel wordt gebruikt in een onafhankelijk, ongepubliceerd project. In plaats daarvan werden de beoogde chromosomale gebieden beschreven.
De genotyperingsanalyses werden uitgevoerd met behulp van een eerder gerapporteerde methode18. Bij deze genotyperingsmethode worden muizen waarbij het donor-DNA op onbedoelde chromosomale plaatsen wordt ingebracht, niet als positieve individuen geteld, zelfs als de gewenste genoombewerking wordt geïnduceerd. Vandaar dat de productie-efficiëntie van de stichtermuizen die echt nuttig zijn voor werkelijke doeleinden werd getoond, in plaats van de efficiëntie van de genoombewerking zelf.
De mediane productie-efficiëntie van 13 onafhankelijke gencassette knock-in muizen was 20,8%, met een maximum van 39,5% en een minimum van 7,9% (tabel 1). Deze efficiëntie werd voldoende praktisch geacht. Eventuele dodelijke embryonale genen waren niet gericht tijdens de gencassette knock-in. Het mediane geboortecijfer onder deze niet-letale gengerichte aandoening was 34,0% (maximaal 43,3% en minimaal 15,9%). Aangezien dit vergelijkbaar is met het geboortecijfer bij embryotransfer zonder genetische manipulatie, waren we van mening dat de toxiciteit van de geïntroduceerde genoombewerkingselementen en de fysieke schade van zygote micro-injectie de embryonale ontwikkeling waarschijnlijk niet zou beïnvloeden.
De mediane productie-efficiëntie van de 10 onafhankelijke floxed muizen was 7,7%, met een maximum van 20,7% en een minimum van 2,1% (tabel 2). Hoewel de functies van verschillende doelgenen onbekend waren, was het mediane geboortecijfer 30,2%, met een maximum van 43,8% en een minimum van 17,3%. Deze snelheid was vergelijkbaar met die van gencassette knock-in muizen, wat suggereert dat de micro-injectie-operatie een verwaarloosbaar effect heeft op de embryonale ontwikkeling van floxed muizen.
Figuur 1: Tijdlijn van zygote micro-injectie. Witte en donkere kleur toont respectievelijk de lichte en donkere cyclus. De muizen werden onder een 14 uur licht/10 uur donkere cyclus gehouden. PMSG: serumgonadotrofine van drachtige merrie; hCG: humaan choriongonadotrofine Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bereiding van kweekschalen . (A) Kweekschaal voor de zygoten vóór de injectie. Plaats twee druppels M16 medium (20-25 μL voor elk) in een plastic petrischaaltje van 35 mm. (B) Kweekschaal voor de zygoten na de injectie. Plaats 10 druppels (10-20 μL voor elke druppel) M16 in een plastic petrischaaltje van 35 mm. Druppels zijn bedekt met minerale olie (3 ml). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gerichte chromosomale regio | Aantal | Inschakellengte (kb) | Homologie armlengte (kb) | ||||||
| Embryo 's | Pasgeborenen | Onderzocht (spenen) | Knock-in zonder rTG | rTGc | |||||
| Geïnjecteerd | overgebracht | 5' arm | 3' arm | ||||||
| 2qE2 | 349 | 331 | 114 (34,4%)a | 114 | 9 (7,9%)b | 5 (4,4%)d | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 2qE2 | 231 | 215 | 78 (36,3%)a | 74 | 15 (20,3%)b | 23 (31.1%)d | 2.2 | 1.0 | 1.1 |
| 5qG2 | 288 | 262 | 90 (34,4%)a | 81 | 19 (23,5%)b | 18 (22,2%)d | 1.6 | 2.0 | 2.0 |
| 6qB1 | 278 | 259 | 58 (22,4%)a | 46 | 11 (23,9%)b | 11 (23,9%)d | 4.2 | 1.2 | 1.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 295 | 277 | 97 (35.0%)a | 23 | 2 (8,7%)b | 4 (17,4%)d | 6.5 | 1.1 | 3.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 246 | 219 | 87 (39,7%)a | 83 | 22 (26,5%)b | 18 (21,7%)d | 5.8 | 1.1 | 3.0 |
| 7qF5 | 279 | 268 | 116 (43,3%)a | 114 | 45 (39,5%)b | 44 (38.6%)d | 1.4 | 3.1 | 1.0 |
| 11qB4 | 405 | 353 | 56 (15,9%)a | 47 | 8 (17,0%)b | 12 (25,5%)d | 1.7 | 1.0 | 0.8 |
| 11qd | 310 | 294 | 100 (34,4%)a | 98 | 15 (15,3%)b | 76 (77,6%)d | 1.0 | 1.8 | 2.4 |
| 12qE | 368 | 320 | 86 (26,9%)a | 84 | 12 (14,3%)b | 19 (22,6%)d | 3.4 | 1.1 | 1.3 |
| 12qF1 | 315 | 265 | 76 (28,7%)a | 72 | 17 (23,6%)b | 28 (38,9%)d | 1.0 | 1.1 | 1.1 |
| 14qE5 | 256 | 215 | 48 (22,3%)a | 48 | 11 (22,9%)b | 21 (43,8%)d | 3.1 | 1.0 | 0.9 |
| 14qE5 | 287 | 285 | 85 (29,8%)a | 72 | 15 (20,8%)b | 19 (26,4%)d | 2.6 | 1.0 | 0.9 |
Tabel 1: Productie van knock-in muizen door micro-injectie. De tabel toont het geboortecijfer en de efficiëntie van het produceren van muizen die het beoogde knock-in allel dragen zonder (W/O) random integration (rTG) van het donor-DNA. Het was mogelijk om in alle projecten muizen te verkrijgen met het beoogde knock-in allel. a: Aantal pasgeborenen/aantal teruggeplaatste embryo's; b: Aantal knock-in allelen gedragen muizen/aantal onderzochte muizen; c: het is niet zeker of er sprake is van een beoogd allel; d: Aantal rTG-allel gedragen muizen/aantal onderzochte muizen; rTG: willekeurige integratie van donorvector. W/O: zonder.
| Gerichte chromosomale regio | Aantal | floxed lengte (kb) | Homologie armlengte (kb) | |||||
| Embryo 's | Pasgeborenen | Onderzocht (spenen) | floxed W/O rTG | |||||
| Geïnjecteerd | overgebracht | 5' arm | 3' arm | |||||
| 3qC | 325 | 313 | 93 (29,7%)a | 87 | 9 (10,3%)b | 1.3 | 1.2 | 1.1 |
| 4qB1 | 210 | 200 | 36 (18.0%)a | 29 | 6 (20,7%)b | 1.6 | 1.2 | 0.9 |
| 4qC4 | 272 | 256 | 112 (43,8%)a | 100 | 5 (5,0%)b | 2.4 | 1.0 | 1.4 |
| 5qF | 143 | 137 | 40 (29,2%)a | 40 | 6 (15,0%)b | 1.8 | 1.0 | 1.1 |
| 5qF | 255 | 227 | 80 (35,2%)a | 76 | 2 (2,6%)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 9qE3,1 | 289 | 261 | 80 (30,7%)a | 77 | 9 (11,7%)b | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| 10qB3 | 284 | 269 | 88 (32,7%)a | 78 | 3 (3,8%)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 10qC1 | 243 | 231 | 40 (17,3%)a | 38 | 4 (10,5%)b | 2.1 | 1.0 | 1.3 |
| 14qE5 | 390 | 372 | 139 (37,4%)a | 135 | 5 (3,7%)b | 1.1 | 0.8 | 0.9 |
| 17qA3,3 | 383 | 374 | 99 (26,5%)a | 95 | 2 (2,1%)b | 2.1 | 0.6 | 0.8 |
Tabel 2: Productie van floxed muizen door micro-injectie. De tabel toont het geboortecijfer en de efficiëntie van het produceren van muizen die het beoogde flox-allel dragen zonder (W / O) willekeurige integratie (rTG) van het donor-DNA. Het was mogelijk om in alle projecten muizen met het beoogde flox-allel te verkrijgen. a: Aantal pasgeborenen/aantal teruggeplaatste embryo's; B: Aantal flox allel gedragen muizen/aantal onderzochte muizen. rTG: willekeurige integratie van of donorvector; W/O: zonder.
Discussion
In de huidige studie werden verse (niet bevroren-ontdooide) C57BL/6J muiszygoten, verkregen uit natuurlijke paring, gebruikt voor de productie van genoombewerkingsmuizen. Door crRNA-tracrRNA-Cas9 en donor-DNA (RNPD) in beide pronuclei van deze zygoten te injecteren in een celcyclusfase waar knock-in het meest waarschijnlijk is, werden gencassette knock-in en floxed muizen gegenereerd met een hoog geboortecijfer en voldoende genoombewerkingsefficiëntie. De huidige studie versterkt de uitbreidbaarheid van de SPRINT-CRISPR-methode15, waar het zorgt voor voldoende knock-in efficiëntie, zelfs in de C57BL / 6J genetische achtergrond, en kan worden toegepast op de productie van floxed muizen.
Elektroporatie is een zeer gegeneraliseerde methode voor het produceren van genoom-bewerkte muizen vanwege de lage kosten van de experimentele apparaten en het gemak van het leren van de techniek8. Bovendien is voor de i-GONAD-methode19, waarbij genoombewerking wordt uitgevoerd met pre-implantatie-embryo's die in de eileider aanwezig zijn, geen ontvangende muis nodig. In vergelijking met deze methoden is de hier gepresenteerde methode kostbaar en tijdrovend bij het voorbereiden en onderhouden van een experimentele omgeving in termen van zowel hardware als software. Zodra de experimentele faciliteiten zijn opgezet, kunnen echter complexe gencassette knock-in en floxed muizen worden geproduceerd met alleen commercieel beschikbare CRISPR-elementen (crRNA, tracrRNA en Cas9-eiwit) en een eenvoudige, kleine hoeveelheid circulaire plasmidevector om te worden gebruikt als donor-DNA. Dit betekent dat veel complexe genoom-bewerkte muislijnen kunnen worden geproduceerd zonder de noodzaak van tijdrovende (of relatief dure) lsODN 5,6 of adeno-geassocieerde virusvectoren20 om voor te bereiden.
In tegenstelling tot de oorspronkelijke SPRINT-CRISPR-methode15 werden verse (bevroren-ontdooide) zygoten gebruikt. Bij het verkrijgen van verse zygoten door natuurlijke paring kunnen de technische fouten worden genegeerd die kunnen optreden tijdens in-vitrofertilisatie of invriezen en ontdooien. Ook kan het embryomanipulatieproces in ongeveer een halve dag worden voltooid (figuur 1) volgens de huidige aanpak. Aan de andere kant zijn enkele beperkingen van de huidige methode de vereiste van veel mannelijke muizen, de losse controle over de bevruchtingstiming en het beperkte vermogen om het aantal zygoten voor micro-injectie volledig te voorspellen. In vergelijking met de oorspronkelijke SPRINT-CRISPR-methode kan deze methode een hoger geboortecijfer hebben (tabel 1). Desondanks kan niet worden geconcludeerd dat de huidige methode beter is in termen van geboortecijfer vanwege de verschillen in de experimentgeleiders, doelgenen, genetische achtergronden en timing van embryobevestiging.
Zoals te zien is in tabel 1, had een groot aantal muizen in de meeste gencassette knock-in projecten willekeurige integratie allelen. Willekeurige integratie moet worden geëlimineerd omdat het kan leiden tot onbedoelde verstoring van endogene genen en ectopische expressie van transgenen. De uitdaging voor de toekomst is om experimentele omstandigheden te vinden die het aantal willekeurige integratiegebeurtenissen verminderen met behoud van voldoende knock-in efficiëntie.
Bijna alle zygote genoombewerking van muizen met behulp van genoombewerkingseffectoren die resulteren in DNA-dubbelstrengsbreuken zal waarschijnlijk onbedoelde mutaties veroorzaken op on-target locaties 9,21. De resultaten van deze onbedoelde on-target mutaties worden hier niet beschreven omdat we ons niet in een situatie bevinden waarin de volgende generatie muizen kan worden beheerd om duidelijk bewijs van hen te presenteren. De beste manier om de bezorgdheid over verwarring veroorzaakt door onbedoelde on-target mutagenese uit te sluiten, is om de volgende generatie muizen te verkrijgen door oprichters te paren met wildtype muizen in plaats van oprichters te kruisen. In principe zijn de N1-muizen die het resultaat zijn van deze kruising wild-type (WT) aan één kant van het allel, dus als het beoogde knock-in (KI) allel wordt gedetecteerd, zijn ze WT / KI heterozygoot. Daarom is de on-target mutagenese geen kritiek probleem bij de laboratoriummuis, die een relatief snelle levenscyclus heeft en een productief dier is. Verdere verbetering zal echter nodig zijn wanneer deze technologie wordt toegepast op relatief grote zoogdieren.
Er is bevestigd dat deze technologie gencassette knock-in muizen kan produceren in andere inteeltstammen dan C57BL / 6J, maar een voldoende aantal projecten is niet beveiligd en de gegevens zijn zeer variabel. Om deze reden is deze informatie niet opgenomen in deze studie. Er wordt aangenomen dat verdere studies over dit onderwerp nodig zullen zijn om het onderzoek naar muizengenetica en ziektemodellen te bevorderen.
Disclosures
De auteurs hebben verklaard geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Wetenschappelijk Onderzoek (B) (19H03142: naar SM), Wetenschappelijk Onderzoek (A) (20H00444: naar FS), Wetenschappelijk Onderzoek (A) (21H04838: naar SM), en Wetenschappelijk Onderzoek naar Innovatieve Gebieden "Platform of Advanced Animal Model Support" (16H06276: naar ST) van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van manuscripten. We zijn Ryoichi Mori dankbaar voor zijn nuttige discussie over genoombewerkingsontwerp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | - | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | - | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | - | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | - | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | - | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | - | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | - | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | - | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | - |
References
- Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
- Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
- Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
- Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
- Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
- Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
- Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
- Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
- Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
- Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
- Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).
