Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रिया के सीडिंग और धुंधला होने का वर्णन करता है। इन कक्षों में द्रव दबाव ढाल कोशिका शरीर के डिब्बे को प्रभावित किए बिना औषधीय चुनौतियों के जवाब में उनके गुणों का विश्लेषण करने के लिए अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रिया के चयनात्मक उपचार की अनुमति देता है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रिया न्यूरॉन्स में एटीपी (एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट) के प्राथमिक आपूर्तिकर्ता हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में एक सामान्य फेनोटाइप है। कुछ अक्षतंतु की विस्तृत वास्तुकला और अत्यधिक लंबाई को देखते हुए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रिया अपने सेल शरीर समकक्षों की तुलना में अलग-अलग वातावरण का अनुभव कर सकते हैं। दिलचस्प बात यह है कि अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया की शिथिलता अक्सर कोशिका शरीर पर प्रभाव से पहले होती है। विट्रो में अक्षीय माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को मॉडल करने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस सोमल माइटोकॉन्ड्रिया को प्रभावित किए बिना अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया के उपचार की अनुमति देते हैं। इन कक्षों में द्रवीय दबाव ढाल ढाल के खिलाफ अणुओं के प्रसार को रोकता है, इस प्रकार अक्षतंतु के भीतर स्थानीय औषधीय चुनौतियों के जवाब में माइटोकॉन्ड्रियल गुणों के विश्लेषण की अनुमति देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में अलग-थलग हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के सीडिंग, झिल्ली-संभावित संवेदनशील डाई के साथ धुंधला, माइटोकॉन्ड्रियल विष के साथ उपचार और बाद के सूक्ष्म विश्लेषण का वर्णन करता है। अक्षीय जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए यह बहुमुखी विधि कई औषधीय गड़बड़ी और इमेजिंग रीडआउट पर लागू की जा सकती है, और कई न्यूरोनल उपप्रकारों के लिए उपयुक्त है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया न्यूरॉन्स में एटीपी (एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट) के मुख्य आपूर्तिकर्ता हैं। चूंकि न्यूरोनल स्वास्थ्य माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन से घनिष्ठ रूप से जुड़ा हुआ है, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि इन ऑर्गेनेल के बेकार विनियमन को पार्किंसंस रोग1 सहित विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की शुरुआत से जोड़ा गया है। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल नशा जानवरों में पार्किंसनियन लक्षणों को मॉडल करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गयाहै। पशु मॉडल और मानव रोग दोनों में, न्यूरॉन्स का निधन डिस्टल भागों 3,4 से शुरू होता है, यह संकेत देते हुए कि अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया अपमान के लिए अधिक संवेदनशील हो सकते हैं। हालांकि, कोशिका शरीर प्रक्रियाओं की एक साथ गड़बड़ी के बिना अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया के लक्षित उपचार और विश्लेषण से जुड़ी कठिनाइयों के कारण अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रिया के जीव विज्ञान को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है।
विट्रो में अलग-थलग न्यूरॉन्स की खेती तकनीकों में हालिया प्रगति अब माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के माध्यम से अक्षतंतु और कोशिका निकायों के द्रव पृथक्करण की अनुमति देतीहै। जैसा कि चित्र 1 ए में दर्शाया गया है, इन उपकरणों में चार एक्सेस कुएं (ए / एच और सी / आई) हैं, जिसमें प्रत्येक जोड़ी (डी और एफ) को जोड़ने वाले दो चैनल हैं। बड़े चैनल 450 μm लंबे माइक्रोचैनलों (e) की एक श्रृंखला द्वारा एक दूसरे के साथ जुड़े हुए हैं। दो कक्षों के बीच भरण स्तरों में जानबूझकर अंतर एक द्रव दबाव ढाल (चित्रा 1 बी) बनाता है जो चैनल से छोटे अणुओं के प्रसार को कम द्रव स्तर के साथ दूसरी तरफ रोकता है (चित्रा 1 सी, ट्रिपैन ब्लू डाई के साथ चित्रित)।
हमने हाल ही में एक्सोनल माइटोफैगी में स्थानीय अनुवाद आवश्यकताओं का अध्ययन करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग किया, क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया6 का चयनात्मक निष्कासन। वर्तमान प्रोटोकॉल में, माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स III अवरोधक एंटीमाइसिन ए 6,7 का उपयोग करके अक्षतंतु के चयनात्मक उपचार के माध्यम से स्थानीय माइटोकॉन्ड्रियल क्षति को प्रेरित करने के लिए विभिन्न चरण प्रस्तुत किए जाते हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी पशु प्रयोग ऊपरी बवेरिया सरकार के प्रासंगिक दिशानिर्देशों और नियमों का पालन करते हुए किए गए थे। प्राथमिक न्यूरॉन्स को दोनों लिंगों के E16.5 C57BL/6 जंगली प्रकार के माउस भ्रूण से मानक विधियों का पालन करते हुए तैयार किया गया था जैसा कि पहले वर्णित6 है।
1. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की असेंबली
- पीबीएस (फॉस्फेट-बफर्ड खारा) में पॉली-डी-लाइसिन के 20 μg / mL और लैमिनिन के 3.4 μg / mL की अंतिम सांद्रता के साथ एक छह-अच्छी ग्लास-बॉटम टिशू कल्चर प्लेट को कोट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- कमरे के तापमान पर अंधेरे में रात भर लेपित प्लेट को इनक्यूबेट करें।
नोट: कोटिंग 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर भी किया जा सकता है। कोटिंग की पसंद उपयोग किए गए सेल प्रकार पर निर्भर करती है। - कोटिंग के बाद, छह-अच्छी प्लेटों को बाँझ हुड में लाएं और उन्हें बाँझ डीडीएच2ओ के साथ दो बार धोएं।
नोट: पीबीएस जैसे नमक युक्त बफर के साथ न धोएं, क्योंकि नमक क्रिस्टल सील गठन में हस्तक्षेप करेंगे। - प्लेट को 3-5 मिनट के लिए झुकी हुई स्थिति में सूखने दें। वैक्यूम सक्शन या पिपेटिंग द्वारा अतिरिक्त पानी निकालें।
- माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष को 80% इथेनॉल में भिगोएं।
नोट: माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। - माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष को झुकी हुई स्थिति में 3-5 मिनट के लिए सूखने दें। वैक्यूम, सक्शन या पिपेटिंग द्वारा अतिरिक्त इथेनॉल को हटा दें।
- पूरी तरह से सूखने पर, कुएं के केंद्र में माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष रखें।
नोट: सील के गठन को प्लेट और सिलिकॉन डिवाइस के बीच इंटरफ़ेस से हवा के बहिष्करण पर प्रतिबिंबित गुणों में परिवर्तन के रूप में देखा जा सकता है। एक अच्छी सील बनाने के लिए असेंबली से पहले प्लेट और माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर दोनों को पूरी तरह से सूखा होना चाहिए। हालांकि, कोशिकाओं के उचित पालन को सुनिश्चित करने के लिए सुखाने के समय को जितना संभव हो उतना कम करने की आवश्यकता है। इसलिए, शेष तरल बूंदों के लिए कुओं और कक्षों का नेत्रहीन निरीक्षण किया जाना चाहिए। यदि कोई बूंद दिखाई नहीं दे रही है, तो तुरंत कक्षों को इकट्ठा करें। - ग्लास प्लेट से उचित लगाव के लिए धीरे से अपनी सीमाओं पर माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष और बीच में माइक्रोग्रूव सेक्शन टैप करें।
2. न्यूरॉन्स का बीजीकरण और रखरखाव
- 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में प्रति कक्ष अलग हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की वांछित संख्या एकत्र करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, इमेजिंग-आधारित अनुप्रयोगों के लिए प्रति डिवाइस1.5 x 10 5 न्यूरॉन्स को बीज दिया गया था। - कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 1000 x g पर सेंट्रीफ्यूज न्यूरॉन्स।
- एक पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और बी 27-न्यूरोबेसल मीडिया के 8 μL में गोली को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष के चैनल प्रवेश द्वार में सेल समाधान को पाइपेट करें (चित्र 1 ए में बी)।
- चैनल के माध्यम से प्रवाह में सहायता के लिए प्लेट के पीछे टैप करें।
नोट: सील टूटने की चिंता के बिना टैपिंग काफी बलपूर्वक की जा सकती है। - चैनल के बाहर कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए चैनल के बाहर (चित्र 1 ए में जी) के बाहर किसी भी शेष सेल निलंबन के साथ एक पिपेट के साथ एस्पिरेटेड।
- माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष को 15-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट करें।
- शीर्ष अक्षीय को B27-न्यूरोबेसल मीडिया के 50 μL के साथ अच्छी तरह से भरें (चित्रा 1 ए में सी)।
- चैनल के माध्यम से प्रवाह में सहायता के लिए प्लेट के पीछे टैप करें।
- सोमा साइड (चित्रा 1 ए में ए और एच) पर कुएं भरें, जिसमें प्रत्येक बी 27-न्यूरोबेसल मीडिया के 150 μL होते हैं, जिससे शीर्ष पर एक तनाव बुलबुला बनता है। बुलबुले की मात्रा लगभग 20 μL है।
नोट: द्रव अलगाव प्राप्त करने के लिए तनाव बुलबुला बनाना आवश्यक नहीं है, लेकिन यह सोमा पक्ष पर उच्च मात्रा का एक स्पष्ट दृश्य प्रदान करता है। - अक्षीय पक्ष (चित्र 1A में c और i) के दोनों कुओं को B27-न्यूरोबेसल मीडिया के 100 μL के साथ भरें।
नोट: माइक्रोग्रूव के माध्यम से अक्षीय विकास को बढ़ावा देने के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि सोमा पक्ष के कुओं में अक्षतंतु पक्ष के कुओं की तुलना में अधिक मीडिया हो। हालांकि, वॉल्यूम अंतर के बिना भी अक्षतंतु संयोग से माइक्रोग्रूव के माध्यम से बढ़ेंगे। - माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष को 7-8 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
नोट: अक्षीय कक्ष में अक्षतंतु की वृद्धि आमतौर पर इन विट्रो (डीआईवी) 5 में दिन से शुरू होती देखी जा सकती है। यदि अधिक परिपक्व संस्कृतियों की इच्छा है तो लंबे समय तक संवर्धन समय संभव है। - दो ऊपरी कुओं (ए और सी) से माध्यम को हटाकर हर 2-3 दिनों में न्यूरॉन्स को खिलाएं और इसे ताजा बी 27-न्यूरोबेसल माध्यम के साथ बदलें जब तक कि तनाव बुलबुला न बन जाए।
3. माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित संवेदनशील डाई के साथ धुंधलापन
- DIV 7-8 पर, आकलन करें कि अक्षतंतु माइक्रोग्रूव के माध्यम से बढ़े हैं और प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे अक्षीय डिब्बे में विस्तारित हुए हैं।
नोट: वांछित उम्र के आधार पर विभिन्न डीआईवी चरण भी संभव हैं। - सभी कुओं से बी 27-न्यूरोबेसल माध्यम को हटाकर और अक्षीय और सोमा चैनलों (ए और सी) दोनों के शीर्ष कुओं में इमेजिंग माध्यम के लगभग 100 μL को जोड़कर पूर्व-गर्म इमेजिंग माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ दो वॉश करें। माध्यम को निचले कुओं (एच और आई) के माध्यम से बहने दें।
- निचले कुओं और शीर्ष कुओं में किसी भी बचे हुए माध्यम से माध्यम को हटा दें, और ताजा माध्यम के साथ दोहराएं, जिससे धोने के अंत में कुओं को खाली छोड़ दिया जाए।
नोट: चैनलों (डी और एफ) में उच्च केशिका बल के कारण, चैनलों में एक शेष धोने का माध्यम होगा जिसे न्यूरॉन्स को सूखने से रोकने के लिए नहीं हटाया जाना चाहिए। किसी भी फिनोल-लाल-मुक्त इमेजिंग माध्यम का उपयोग यहां किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, हाइबरनेट ई ( सामग्री की तालिका देखें)। यदि माइक्रोस्कोप सीओ2 आपूर्ति के साथ स्थापित नहीं है, तो सुनिश्चित करें कि इमेजिंग माध्यम कार्बोनेट / सीओ2 (जैसे, एचईपीईएस) 8 के लिए एक वैकल्पिक बफरिंग सिस्टम का उपयोग करता है।
- निचले कुओं और शीर्ष कुओं में किसी भी बचे हुए माध्यम से माध्यम को हटा दें, और ताजा माध्यम के साथ दोहराएं, जिससे धोने के अंत में कुओं को खाली छोड़ दिया जाए।
- इमेजिंग माध्यम में 5 एनएम तक 1 एमएम टेट्रामिथाइलरोडामाइन एथिल एस्टर (टीएमआरई, लाल, सामग्री की तालिका देखें) स्टॉक को पतला करें।
नोट: विषाक्तता से बचने के लिए अंतिम कमजोर पड़ने में 1% डीएमएसओ से अधिक न करें। - दैहिक और अक्षीय शीर्ष कुओं (ए और सी) दोनों में 5 एनएम टीएमआरई तनुकरण का 100 μL जोड़ें, और माध्यम को दैहिक और अक्षीय दोनों डिब्बों के माध्यम से प्रवाहित होने दें जब तक कि सभी कुओं में समान मात्रा न हो। टीएमआरई युक्त माध्यम से भरें।
- न्यूरॉन्स को 25 मिनट के लिए एक नियंत्रित वातावरण कक्ष (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) में वापस रखें।
- पहले वर्णित (चरण 3.2) के रूप में पूर्व-गर्म इमेजिंग माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ दो वॉश करें। अंतिम धोने पर, प्रत्येक कुएं में 100 μL से भरें और दैहिक कुओं (a और c) पर माध्यम का तनाव बुलबुला बनाएं।
4. लाइव-सेल इमेजिंग
नोट: अभी भी दिखाए गए चित्रों को 40x NA 1.25 विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। लाल चैनल के लिए 200 एमएस एक्सपोज़र समय और 10% लेजर पावर और ब्राइटफील्ड के लिए 500 एमएस एक्सपोज़र टाइम चुना गया था। हालांकि, टीएमआरई तीव्रता का अध्ययन करने के लिए नियमित कॉन्फोकल या वाइडफील्ड इनवर्टेड माइक्रोस्कोप का भी उपयोग किया जा सकता है।
- एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की छवि बनाएं।
- सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप पूरे प्रयोग के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर न्यूरोनल संस्कृति को बनाए रखने के लिए एक चरण इनक्यूबेटर से लैस है।
- दैहिक डिब्बे में रुचि के क्षेत्र का चयन करें, और इसे माइक्रोग्रूव के माध्यम से अक्षीय डिब्बे में पालन करें। सुनिश्चित करें कि चित्रित माइक्रोग्रूव दैहिक और अक्षीय डिब्बों (आसान बेसलाइन और पोस्ट-ट्रीटमेंट तुलना के लिए) में उन लोगों से मेल खाते हैं।
- लाल प्रतिदीप्ति संकेत के लिए 561 एनएम पर उत्तेजना और 625 एनएम पर उत्सर्जन का उपयोग करके प्रतिदीप्ति छवियों को कैप्चर करें।
- छवियों को प्राप्त करें।
- माइटोकॉन्ड्रियल विध्रुवण को प्रेरित करने के लिए, अक्षीय डिब्बे में इमेजिंग माध्यम में 20 μM Antimycin A ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। सोमा और अक्षीय कक्षों के बीच मात्रा अंतर सुनिश्चित करने के लिए, दैहिक पक्ष पर तनाव बुलबुले की उपस्थिति की जांच करें (वॉल्यूम >110 μL के बराबर)।
- चैनल (एफ) के अंदर माध्यम को छोड़कर, अक्षीय पक्ष (आई) के निचले कुएं से सभी इमेजिंग माध्यम को हटा दें। शीर्ष अक्षीय कुएं (सी) में 20 μM एंटीमाइसिन A का 160 μL जोड़ें और इसे चैनल के माध्यम से बहने दें जब तक कि दोनों अक्षीय कुओं में समान मात्रा न हो। अक्षीय कुओं में मात्रा लगभग 80 μL प्रति कुएं है।
नोट: सुनिश्चित करें कि उचित द्रव दबाव सुनिश्चित करने के लिए अक्षीय कुओं में मात्रा दैहिक कुओं की तुलना में छोटी है। कम से कम 10 μL (अच्छी मात्रा का 10%) के अंतर की सिफारिश की जाती है, लेकिन उच्च अंतर भी संभव हैं।
- चैनल (एफ) के अंदर माध्यम को छोड़कर, अक्षीय पक्ष (आई) के निचले कुएं से सभी इमेजिंग माध्यम को हटा दें। शीर्ष अक्षीय कुएं (सी) में 20 μM एंटीमाइसिन A का 160 μL जोड़ें और इसे चैनल के माध्यम से बहने दें जब तक कि दोनों अक्षीय कुओं में समान मात्रा न हो। अक्षीय कुओं में मात्रा लगभग 80 μL प्रति कुएं है।
- 20-30 मिनट के लिए नियंत्रित पर्यावरण कक्ष (37 डिग्री सेल्सियस) में न्यूरॉन्स को इनक्यूबेट करें।
- ऊपर वर्णित के रूप में इमेजिंग दोहराएं (चरण 4.3-4.5)। सुनिश्चित करें कि बेसलाइन अधिग्रहण के दौरान समान पदों को चित्रित किया गया है (माइक्रोग्रूव द्वारा आसानी से पहचाना जाता है)।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में 7-8 दिनों के लिए उगाया गया था, इससे पहले कि माइटोकॉन्ड्रिया को दोनों चैनलों में 25 मिनट के लिए झिल्ली-संवेदनशील डाई (टीएमआरई) से दाग दिया गया था। जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है, इससे माइक्रोग्रूव के दोनों किनारों पर माइटोकॉन्ड्रिया का समरूप धुंधलापन हुआ, फिर भी यह माइक्रोग्रूव के बीच में धुंधलापन को बराबर करने के लिए अपर्याप्त था। अक्षीय पक्ष में एंटीमाइसिन ए को जोड़ने पर, सोमल माइटोकॉन्ड्रिया ने टीएमआरई सिग्नल (चित्रा 2 बी और वीडियो 1) को बरकरार रखा, जबकि टीएमआरई फ्लोरेसेंस अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया (चित्रा 2 सी और वीडियो 1) से खो गया था। वीडियो को पूरी तरह से एकीकृत डिजिटल वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके कैप्चर किया गया था।
चित्रा 1: माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस अक्षतंतु के द्रविक अलगाव की अनुमति देते हैं। (ए) इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का योजनाबद्ध। सिलिकॉन डिस्क (व्यास 21 मिमी) छह-अच्छी प्लेट में आसानी से फिट बैठता है। a) सोमा की तरफ अच्छी तरह से, b) सोमा साइड पर चैनल का प्रवेश, c) अक्षतंतु की तरफ अच्छी तरह से, d) सोमा साइड पर चैनल, e) माइक्रोग्रूव्स, f) चैनल अक्षतंतु की तरफ, g) चैनल का सोमा साइड पर बाहर निकलना, h) सोमा साइड पर अच्छी तरह से, i) अक्षतंतु की तरफ अच्छी तरह से। (बी) योजनाबद्ध विवरण कि विभिन्न द्रव स्तर माइक्रोचैनलों में एक तरल दबाव ढाल कैसे बनाते हैं। (सी) कक्ष के एक तरफ ट्रिपैन ब्लू को जोड़कर द्रविक अलगाव का प्रदर्शन। ध्यान दें कि द्रव दबाव ढाल के कारण, नीली डाई माइक्रोचैनलों में समतुल्य नहीं होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: अक्षतंतु का चयनात्मक उपचार अक्षीय लेकिन सेल बॉडी माइटोकॉन्ड्रिया को विध्रुवित करता है। (ए) प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में टीएमआरई धुंधला होने की प्रभावशीलता का अवलोकन प्रस्तुत करता है। स्केल बार = 100 μm. (B-C) प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ अक्षीय डिब्बे में 20 μM Antimycin A (AA) जोड़ने से पहले और बाद में सेल बॉडी और अक्षीय डिब्बे में एक ही क्षेत्र को दर्शाता है। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 1: अक्षतंतु और कोशिका निकायों में माइटोकॉन्ड्रिया पर एंटीमाइसिन ए उपचार का प्रभाव। एंटीमाइसिन ए जोड़ने पर टीएमआरई फ्लोरेसेंस के नुकसान की लाइव सेल इमेजिंग कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में अलग-अलग हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स को बीज और संस्कृति करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है ताकि अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया का अलग से इलाज किया जा सके। झिल्ली-संवेदनशील डाई टीएमआरई और जटिल III अवरोधक एंटीमाइसिन ए (जैसा कि पहले प्रदर्शितकिया गया था 7) के साथ इस दृष्टिकोण की उपयोगिता यहां प्रदर्शित की गई है, लेकिन इस विधि को आसानी से अन्य माइटोकॉन्ड्रियल रंगों या माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों के आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो स्थानीय, माइक्रोस्कोपी-आधारित रीडआउट9 की अनुमति देते हैं। अन्य न्यूरोनल सेल प्रकारों को माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में भी उगाया जा सकता है, जैसे कि प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स10 या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी)-व्युत्पन्न मोटरन्यूरॉन11, जिससे यह मंच न्यूरोनल सेल प्रकार की रुचि में न्यूरोडीजेनेरेशन में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण बन जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की असेंबली एक कुशल सील प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है और एक अनुभवी शोधकर्ता को असेंबली करते हुए देखकर सबसे आसानी से समझाया जाता है। यहां वर्णित डाउनस्ट्रीम लेबलिंग और उपचार प्रक्रिया अनुकरणीय होने के लिए हैं और द्रव दबाव ढाल को बनाए रखते हुए संबंधित प्रयोगशालाओं में वर्तमान में स्थापित प्रोटोकॉल को फिट करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।
यहां वर्णित सीडिंग तकनीक प्रकाशित प्रोटोकॉल और निर्माता के विवरण से भिन्न है, क्योंकि हम इकट्ठे डिवाइस के सुझाए गए वॉश को छोड़ देते हैं और इसके बजाय सीधे विघटित न्यूरॉन्स को सूखे कक्ष (खंड 2) में बीज देते हैं। यह देखा गया है कि यह आवश्यक न्यूरॉन्स की संख्या को कम करता है, क्योंकि यह चैनल (ई) के भीतर न्यूरॉन्स के घनत्व को बढ़ाता है और माइक्रोचैनलों से दूर कुओं में न्यूरॉन्स के प्रसार को सीमित करता है। ड्राई सीडिंग को प्लेट के निचले हिस्से (चरण 2.5) को टैप करके सहायता प्रदान की जाती है, जो डिवाइस को इकट्ठा करते समय पहले लगाए गए बल के आधार पर आवश्यक हो सकता है या नहीं भी हो सकता है।
हालांकि, इस प्रक्रिया में कुछ सीमाएं मौजूद हैं। असेंबली के दौरान लागू बल में अंतर के कारण सील की जकड़न में कुछ परिवर्तनशीलता है जो माइक्रोग्रूव्स के माध्यम से प्रतिबंधित विकास का कारण बन सकती है। इसके अलावा, शेष नमी सील गठन को परेशान कर सकती है और डिवाइस के नीचे अक्षीय विकास या यहां तक कि सेल माइग्रेशन की अनुमति दे सकती है। दोनों समस्याओं को धुंधला होने से पहले आसानी से देखा जा सकता है, जिससे प्रयोग से दोषपूर्ण कक्षों का बहिष्करण होता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (एचए 7728/2-1 और एक्ससी 2145 प्रोजेक्ट आईडी 390857198) और मैक्स प्लैंक सोसाइटी द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
