طريقة العزل للخلايا الجذعية المكونة للدم على المدى الطويل والقصير
Summary
نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم على المدى الطويل (LT-HSCs) والخلايا الجذعية المكونة للدم على المدى القصير (ST-HSCs) باستخدام نظام مراسل Hoxb5.
Abstract
تعتبر قدرة التجديد الذاتي وإمكانية التمايز متعدد السلالات بشكل عام من الخصائص المميزة للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs). ومع ذلك ، فقد اقترحت العديد من الدراسات أن عدم التجانس الوظيفي موجود في حجرة HSC. أبلغت التحليلات الحديثة أحادية الخلية عن استنساخ HSC مع مصائر خلايا مختلفة داخل حجرة HSC ، والتي يشار إليها باسم استنساخ HSC المتحيز. الآليات الكامنة وراء النتائج غير المتجانسة أو غير القابلة للتكرار بشكل سيئ غير مفهومة ، خاصة فيما يتعلق بطول التجديد الذاتي عندما يتم زرع أجزاء HSC المنقاة بواسطة التلوين المناعي التقليدي. لذلك ، فإن إنشاء طريقة عزل قابلة للتكرار ل HSCs طويلة الأجل (LT-HSCs) و HSCs قصيرة الأجل (ST-HSCs) ، والتي تحددها مدة تجديدها الذاتي ، أمر بالغ الأهمية للتغلب على هذه المشكلة. باستخدام فحص متعدد الخطوات غير متحيز ، حددنا عامل النسخ ، Hoxb5 ، والذي قد يكون علامة حصرية ل LT-HSCs في نظام المكونة للدم في الفأر. بناء على هذه النتيجة ، أنشأنا خط ماوس مراسل Hoxb5 ونجحنا في عزل LT-HSCs و ST-HSCs. هنا نصف بروتوكولا مفصلا لعزل LT-HSCs و ST-HSCs باستخدام نظام مراسل Hoxb5 . ستساعد طريقة العزل هذه الباحثين على فهم آليات التجديد الذاتي والأساس البيولوجي لمثل هذا التباين في حجرة HSC بشكل أفضل.
Introduction
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، التي تمتلك قدرة التجديد الذاتي وتعدد القدرات ، تقع في قمة التسلسل الهرمي المكونة للدم 1,2. في عام 1988 ، أظهر وايزمان وزملاؤه لأول مرة أنه يمكن تحقيق عزل HSCs للفأر باستخدام قياس التدفقالخلوي 3. بعد ذلك ، تم الإبلاغ عن جزء محدد بواسطة مجموعة من علامات سطح الخلية ، Lineage−c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34− / loFlk2− ، يحتوي على جميع HSCs في الفئران4،5،6،7،8.
تم اعتبار HSCs المعرفة المناعية (Lineage−c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34− / loFlk2−) HSCs (المشار إليها فيما يلي ، pHSCs) متجانسة وظيفيا. ومع ذلك ، فقد كشفت التحليلات الحديثة أحادية الخلية أن pHSCs لا تزال تظهر عدم تجانس فيما يتعلق بقدرتها على التجديد الذاتي9,10 وتعدد القدرات11,12. على وجه التحديد ، يبدو أن هناك مجموعتين سكانيتين في جزء pHSC فيما يتعلق بقدرتها على التجديد الذاتي: الخلايا الجذعية المكونة للدم على المدى الطويل (LT-HSCs) ، والتي تتمتع بقدرة التجديد الذاتي المستمر ، والخلايا الجذعية المكونة للدم على المدى القصير (ST-HSCs) ، والتي لديها قدرة تجديد ذاتي عابرة 9,10.
حتى الآن ، لا تزال الآليات الجزيئية لقدرة التجديد الذاتي التي تميز LT-HSCs و ST-HSCs غير مفهومة بشكل جيد. من الأهمية بمكان عزل كل من مجموعات الخلايا بناء على قدراتها على التجديد الذاتي واكتشاف الآليات الجزيئية الأساسية. كما تم إدخال العديد من أنظمة المراسلين لتنقية LT-HSCs13،14،15 ؛ ومع ذلك ، فإن نقاء LT-HSC المحدد من قبل كل نظام مراسل متغير ، ولم يتم تحقيق تنقية LT-HSC الحصرية حتى الآن.
لذلك ، فإن تطوير نظام عزل ل LT-HSCs و ST-HSCs سيسرع البحث فيما يتعلق بقدرة التجديد الذاتي في جزء pHSC. في عزل LT-HSCs و ST-HSCs ، حددت دراسة تستخدم فحصا متعدد الخطوات وغير متحيز جينا واحدا ، Hoxb5 ، يتم التعبير عنه بشكل غير متجانس في جزء pHSC16. بالإضافة إلى ذلك ، كشف تحليل نخاع العظم للفئران مراسل Hoxb5 أن ما يقرب من 20٪ -25٪ من جزء pHSC يتكون من خلايانقاط البيع Hoxb5. كشف فحص زرع تنافسي باستخدام Hoxb5pos pHSCs و Hoxb5 neg pHSCs أن Hoxb5 pos pHSCs فقط تمتلك قدرة تجديد ذاتي طويلة الأجل ، بينما تفقد Hoxb5neg pHSCs قدرتها على التجديد الذاتي في غضون فترة قصيرة ، مما يشير إلى أن Hoxb5 يحدد LT-HSCs فيجزء pHSC 16.
هنا ، نوضح بروتوكولا خطوة بخطوة لعزل LT-HSCs و ST-HSCs باستخدام نظام مراسل Hoxb5 . بالإضافة إلى ذلك ، نقدم مقايسة زرع تنافسية لتقييم قدرة التجديد الذاتي ل Hoxb5pos / neg pHSCs (الشكل 1). يسمح لنا نظام مراسل Hoxb5 هذا بعزل LT-HSCs و ST-HSCs بشكل مستقبلي ويساهم في فهم الخصائص الخاصة ب LT-HSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقليديا ، تم إعداد HSCs المحددة بعلامات سطح الخلية لدراسة وظائف HSCs ، مثل قدرة التجديد الذاتي ومتعددة الإمكانات19،20،21. ومع ذلك ، فإن جزء HSC المحدد بشكل مناعي (Lineage −c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34− / loFlk2−) يحتوي على مجموعتين منف?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بامتنان هيروشي كيوناري لرعاية الحيوانات ولتوفير الفئران المتلقية في RIKEN BDR ، وكذلك هيتومي أوغا وكايوكو ناغازاكا وماساكي مياهاشي لإدارة المختبرات في جامعة كوبي. كما يقدر المؤلفون تقديرا كبيرا الدعم المستمر لهذا العمل. تم دعم Masanori Miyanishi من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) أرقام منحة KAKENHI JP17K07407 و JP20H03268 ، ومؤسسة Mochida التذكارية للبحوث الطبية والصيدلانية ، ومؤسسة علوم الحياة في اليابان ، ومؤسسة Takeda للعلوم ، ومؤسسة Astellas لأبحاث الاضطرابات الأيضية ، و AMED-PRIME ، AMED بموجب رقم المنحة JP18gm6110020. تارو ساكاماكي مدعوم من قبل أرقام منحة JSPS KAKENHI JP21K20669 و JP22K16334 وتم دعمه من قبل برنامج JSPS من النواة إلى النواة وبرنامج RIKEN للباحثين الصغار. تم دعم كاتسويوكي نيشي من قبل رقم منحة JSPS KAKENHI JP18J13408.
Materials
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
Referências
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
- Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
- Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
- Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075 (2016).
- Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
- Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
- Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
- Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
- Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
- Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
- Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
- Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).
