Método de Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas de Longa e Curta Duração
Summary
Apresentamos um protocolo passo a passo para o isolamento de células-tronco hematopoéticas de longa duração (CT-HSCs) e CTHs de curta duração (CTH-ST) utilizando o sistema repórter Hoxb5.
Abstract
A capacidade de autorrenovação e o potencial de diferenciação de múltiplas linhagens são geralmente considerados como as características definidoras das células-tronco hematopoéticas (CTH). No entanto, numerosos estudos têm sugerido que existe heterogeneidade funcional no compartimento das CTH. Análises recentes de célula única relataram clones de HSC com diferentes destinos celulares dentro do compartimento HSC, que são referidos como clones de HSC tendenciosos . Os mecanismos subjacentes aos resultados heterogêneos ou pouco reprodutíveis são pouco compreendidos, especialmente em relação ao tempo de auto-renovação quando frações purificadas de HSC são transplantadas por imunomarcação convencional. Portanto, estabelecer um método de isolamento reprodutível para HSCs de longa duração (CT-HSCs) e de curta duração (HSCs-ST), definido pelo tempo de sua auto-renovação, é crucial para superar essa questão. Usando triagem multi-etapa imparcial, identificamos um fator de transcrição, Hoxb5, que pode ser um marcador exclusivo de LT-HSCs no sistema hematopoiético de camundongos. Com base nesse achado, estabelecemos uma linhagem de camundongos repórteres Hoxb5 e isolamos com sucesso LT-HSCs e ST-HSCs. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de LT-HSCs e ST-HSCs usando o sistema de repórteres Hoxb5 . Este método de isolamento ajudará os pesquisadores a entender melhor os mecanismos de auto-renovação e as bases biológicas para tal heterogeneidade no compartimento HSC.
Introduction
As células-tronco hematopoéticas (CTH), que possuem capacidade de autorrenovação e multipotência, residem no ápice da hierarquia hematopoética 1,2. Em 1988, Weissman e colaboradores demonstraram pela primeira vez que o isolamento de HSCs de camundongos poderia ser obtido usando citometria de fluxo3. Posteriormente, uma fração definida por uma combinação de marcadores de superfície celular, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, foi relatada como contendo todas as CTHs em camundongos 4,5,6,7,8.
As HSCs imunofenotipicamente definidas (Linhagem−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/lo Flk2−) (doravante, pHSCs) foram previamente consideradas funcionalmente homogêneas. No entanto, análises recentes de células únicas têm revelado que as pHSCs ainda exibem heterogeneidade em relação à sua capacidade de autorrenovação 9,10 e multipotência11,12. Especificamente, duas populações parecem existir na fração pHSC no que diz respeito à sua capacidade de autorrenovação: as células-tronco hematopoéticas de longa duração (CTH-LT), que têm capacidade de auto-renovação contínua, e as células-tronco hematopoéticas de curto prazo (CTH-ST), que têm capacidade de autorrenovação transitória 9,10.
Até o momento, os mecanismos moleculares da capacidade de auto-renovação que distinguem LT-HSCs e ST-HSCs permanecem pouco compreendidos. É crucial isolar ambas as populações celulares com base em suas capacidades de auto-renovação e descobrir mecanismos moleculares subjacentes. Vários sistemas repórteres também foram introduzidos para purificar LT-HSCs13,14,15; no entanto, a pureza LT-HSC definida por cada sistema repórter é variável, e a purificação exclusiva de LT-HSC não foi alcançada até o momento.
Portanto, o desenvolvimento de um sistema de isolamento para LT-HSCs e ST-HSCs acelerará as pesquisas sobre a capacidade de auto-renovação na fração pHSC. No isolamento de LT-HSCs e ST-HSCs, um estudo utilizando triagem em várias etapas e sem viés identificou um único gene, Hoxb5, que é heterogeneamente expresso na fração pHSC16. Além disso, a análise da medula óssea dos camundongos repórteres Hoxb5 revelou que aproximadamente 20%-25% da fração pHSC consiste de células Hoxb5 pos. Um ensaio competitivo de transplante usando pHSCs Hoxb5 pos e pHSCs Hoxb5 neg revelou que apenas as pHSCs Hoxb5pos possuem capacidade de auto-renovação de longo prazo, enquanto aspHSCs Hoxb5neg perdem sua capacidade de auto-renovação em um curto período, indicando que Hoxb5 identifica LT-HSCs na fraçãopHSC 16.
Aqui, demonstramos um protocolo passo a passo para isolar LT-HSCs e ST-HSCs usando o sistema de relatório Hoxb5 . Além disso, apresentamos um ensaio competitivo de transplante para avaliar a capacidade de autorrenovação das pHSCs Hoxb5pos/neg (Figura 1). Este sistema de reporte Hoxb5 nos permite isolar prospectivamente LT-HSCs e ST-HSCs e contribui para o entendimento das características específicas de LT-HSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tradicionalmente, as CTHs definidas por marcadores de superfície celular têm sido preparadas para estudar as funções das CTHs, como a capacidade de autorrenovação e a multipotência19,20,21. Entretanto, a fração HSC imunofenotipicamente definida (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) contém duas populações discretas de HSC: LT-HSCs e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Hiroshi Kiyonari pelo cuidado com os animais e por fornecer camundongos receptores na RIKEN BDR, bem como Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka e Masaki Miyahashi pela gestão do laboratório na Universidade de Kobe. Os autores também apreciam muito o apoio contínuo a este trabalho. Masanori Miyanishi foi apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 e JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders, e AMED-PRIME, AMED sob o número de concessão JP18gm6110020. Taro Sakamaki é suportado por JSPS KAKENHI Grant Numbers JP21K20669 e JP22K16334 e foi apoiado por o Programa Core-to-Core da JSPS e o Programa Associado de Pesquisa Júnior RIKEN. Katsuyuki Nishi foi apoiado pelo JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.
Materials
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
Referências
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
- Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
- Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
- Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075 (2016).
- Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
- Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
- Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
- Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
- Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
- Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
- Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
- Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).
