Isolationsmethode für lang- und kurzfristige hämatopoetische Stammzellen
Summary
Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von langfristigen hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSCs) und Kurzzeit-HSCs (ST-HSCs) mit dem Hoxb5-Reportersystem vor.
Abstract
Die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und das Differenzierungspotenzial mehrerer Linien gelten allgemein als die bestimmenden Merkmale hämatopoetischer Stammzellen (HSCs). Zahlreiche Studien deuten jedoch darauf hin, dass im HSC-Kompartiment funktionelle Heterogenität besteht. Neuere Einzelzellanalysen haben über HSC-Klone mit unterschiedlichen Zellschicksalen innerhalb des HSC-Kompartiments berichtet, die als biased HSC-Klone bezeichnet werden. Die Mechanismen, die heterogenen oder schlecht reproduzierbaren Ergebnissen zugrunde liegen, sind wenig verstanden, insbesondere im Hinblick auf die Dauer der Selbsterneuerung, wenn gereinigte HSZ-Fraktionen durch konventionelle Immunfärbung transplantiert werden. Daher ist die Etablierung einer reproduzierbaren Isolationsmethode für Langzeit-HSZ (LT-HSCs) und Kurzzeit-HSZ (ST-HSCs), definiert durch die Dauer ihrer Selbsterneuerung, entscheidend für die Überwindung dieses Problems. Mit Hilfe eines unverzerrten mehrstufigen Screenings konnten wir einen Transkriptionsfaktor, Hoxb5, identifizieren, der ein exklusiver Marker für LT-HSCs im hämatopoetischen System der Maus sein könnte. Basierend auf diesen Erkenntnissen etablierten wir eine Hoxb5-Reportermauslinie und isolierten erfolgreich LT-HSCs und ST-HSCs. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von LT-HSCs und ST-HSCs unter Verwendung des Hoxb5-Reportersystems . Diese Isolationsmethode wird den Forschern helfen, die Mechanismen der Selbsterneuerung und die biologischen Grundlagen für diese Heterogenität im HSZ-Kompartiment besser zu verstehen.
Introduction
Hämatopoetische Stammzellen (HSZ), die über Selbsterneuerungsfähigkeit und Multipotenz verfügen, befinden sich an der Spitze der hämatopoetischen Hierarchie 1,2. 1988 zeigten Weissman und Kollegen erstmals, dass die Isolierung von HSZ bei Mäusen mit Hilfe der Durchflusszytometrie erreicht werden kann3. Anschließend wurde berichtet, dass eine Fraktion, die durch eine Kombination von Zelloberflächenmarkern definiert wurde, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, alle HSCs in Mäusen 4,5,6,7,8 enthält.
Immunphänotypisch definierte (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSZ (im Folgenden pHSCs) galten bisher als funktionell homogen. Neuere Einzelzellanalysen haben jedoch gezeigt, dass pHSCs immer noch Heterogenität in Bezug auf ihre Selbsterneuerungskapazität9,10 und Multipotenz 11,12 aufweisen. Konkret scheinen in der pHSC-Fraktion zwei Populationen hinsichtlich ihrer Selbsterneuerungskapazität zu existieren: langfristige hämatopoetische Stammzellen (LT-HSCs), die eine kontinuierliche Selbsterneuerungskapazität aufweisen, und kurzzeitige hämatopoetische Stammzellen (ST-HSCs), die eine transiente Selbsterneuerungskapazität aufweisen 9,10.
Die molekularen Mechanismen der Selbsterneuerungsfähigkeit, die LT-HSZ und ST-HSZ unterscheiden, sind bisher nur unzureichend verstanden. Es ist von entscheidender Bedeutung, beide Zellpopulationen anhand ihrer Selbsterneuerungsfähigkeit zu isolieren und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu entdecken. Es wurden auch mehrere Reportersysteme eingeführt, um LT-HSCs13,14,15 zu reinigen; Die von jedem Reportersystem definierte LT-HSC-Reinheit ist jedoch variabel, und eine ausschließliche LT-HSC-Reinigung wurde bisher nicht erreicht.
Daher wird die Entwicklung eines Isolationssystems für LT-HSCs und ST-HSCs die Erforschung der Selbsterneuerungsfähigkeit in der pHSC-Fraktion beschleunigen. Bei der Isolierung von LT-HSCs und ST-HSCs wurde in einer Studie mit mehrstufigem, unverzerrtem Screening ein einzelnes Gen, Hoxb5, identifiziert, das heterogen in der pHSC-Fraktion16 exprimiert wird. Darüber hinaus ergab die Knochenmarkanalyse der Hoxb5-Reportermäuse, dass etwa 20%-25% der pHSC-Fraktion aus Hoxb5-pos-Zellen besteht. Ein kompetitiver Transplantationsassay mit Hoxb5 pos pHSCs und Hoxb5 neg pHSCs zeigte, dass nur Hoxb5pos pHSCs eine langfristige Selbsterneuerungskapazität besitzen, während Hoxb5neg pHSCs ihre Selbsterneuerungskapazität innerhalb kurzer Zeit verlieren, was darauf hindeutet, dass Hoxb5 LT-HSCs in der pHSC-Fraktion16 identifiziert.
Hier demonstrieren wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Isolierung von LT-HSCs und ST-HSCs mit dem Hoxb5-Reportersystem . Darüber hinaus präsentieren wir einen kompetitiven Transplantationsassay zur Beurteilung der Selbsterneuerungskapazität von Hoxb5pos/neg pHSCs (Abbildung 1). Dieses Hoxb5-Reportersystem ermöglicht es uns, LT-HSCs und ST-HSCs prospektiv zu isolieren und trägt zum Verständnis von LT-HSC-spezifischen Eigenschaften bei.
Protocol
Representative Results
Discussion
Traditionell wurden HSCs, die durch Zelloberflächenmarker definiert sind, hergestellt, um die Funktionen von HSCs zu untersuchen, wie z. B. die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Multipotenz 19,20,21. Die immunphänotypisch definierte (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC-Fraktion enthält jedoch zwei diskrete HSZ-Populationen: LT-HS…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Hiroshi Kiyonari für die Tierpflege und die Bereitstellung von Empfängermäusen am RIKEN BDR sowie Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka und Masaki Miyahashi für das Labormanagement an der Universität Kobe. Die Autoren schätzen auch die anhaltende Unterstützung für diese Arbeit sehr. Masanori Miyanishi wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 und JP20H03268, der Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, der Life Science Foundation of Japan, der Takeda Science Foundation, der Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders und AMED-PRIME, AMED unter der Fördernummer JP18gm6110020 unterstützt. Taro Sakamaki wird von den JSPS KAKENHI Grant Numbers JP21K20669 und JP22K16334 unterstützt und wurde unterstützt von das JSPS Core-to-Core-Programm und das RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi wurde durch die JSPS-Fördernummer KAKENHI JP18J13408 unterstützt.
Materials
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
Referências
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