Metodo di isolamento per cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine
Summary
Presentiamo un protocollo passo-passo per l’isolamento di cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs) e HSCs a breve termine (ST-HSCs) utilizzando il sistema reporter Hoxb5.
Abstract
La capacità di auto-rinnovamento e il potenziale di differenziazione multi-lineage sono generalmente considerati come le caratteristiche distintive delle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Tuttavia, numerosi studi hanno suggerito che esiste eterogeneità funzionale nel compartimento HSC. Recenti analisi a singola cellula hanno riportato cloni HSC con diversi destini cellulari all’interno del compartimento HSC, che sono indicati come cloni HSC distorti. I meccanismi alla base di risultati eterogenei o scarsamente riproducibili sono poco compresi, soprattutto per quanto riguarda la durata dell’auto-rinnovamento quando le frazioni HSC purificate vengono trapiantate mediante immunocolorazione convenzionale. Pertanto, stabilire un metodo di isolamento riproducibile per le HSC a lungo termine (LT-HSC) e le HSC a breve termine (ST-HSC), definite dalla durata del loro auto-rinnovamento, è fondamentale per superare questo problema. Utilizzando uno screening imparziale multi-step, abbiamo identificato un fattore di trascrizione, Hoxb5, che potrebbe essere un marker esclusivo di LT-HSC nel sistema ematopoietico del topo. Sulla base di questa scoperta, abbiamo stabilito una linea di topi reporter Hoxb5 e isolato con successo LT-HSC e ST-HSC. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l’isolamento di LT-HSC e ST-HSC utilizzando il sistema di reporter Hoxb5 . Questo metodo di isolamento aiuterà i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi di auto-rinnovamento e le basi biologiche di tale eterogeneità nel compartimento HSC.
Introduction
Le cellule staminali ematopoietiche (HSC), che possiedono capacità di auto-rinnovamento e multipotenza, risiedono all’apice della gerarchia ematopoietica 1,2. Nel 1988, Weissman e colleghi hanno dimostrato per la prima volta che l’isolamento delle HSC di topo potrebbe essere ottenuto utilizzando la citometria a flusso3. Successivamente, una frazione definita da una combinazione di marcatori di superficie cellulare, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, è stata riportata per contenere tutte le HSC nei topi 4,5,6,7,8.
Le HSCs immunofenotipicamente definite (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) (di seguito, pHSCs) sono state precedentemente considerate funzionalmente omogenee. Tuttavia, recenti analisi monocellulari hanno rivelato che le pHSC mostrano ancora eterogeneità rispetto alla loro capacità di auto-rinnovamento9,10 e multipotenza11,12. In particolare, nella frazione pHSC sembrano esistere due popolazioni per quanto riguarda la loro capacità di auto-rinnovamento: le cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs), che hanno una capacità di auto-rinnovamento continuo, e le cellule staminali ematopoietiche a breve termine (ST-HSCs), che hanno capacità transitorie di auto-rinnovamento 9,10.
Ad oggi, i meccanismi molecolari della capacità di auto-rinnovamento che distinguono LT-HSCs e ST-HSCs rimangono poco conosciuti. È fondamentale isolare entrambe le popolazioni cellulari in base alle loro capacità di auto-rinnovamento e scoprire i meccanismi molecolari sottostanti. Sono stati inoltre introdotti diversi sistemi di segnalazione per purificare LT-HSC13,14,15; tuttavia, la purezza LT-HSC definita da ciascun sistema reporter è variabile e la purificazione LT-HSC esclusiva non è stata raggiunta fino ad oggi.
Pertanto, lo sviluppo di un sistema di isolamento per LT-HSC e ST-HSC accelererà la ricerca sulla capacità di auto-rinnovamento nella frazione pHSC. Nell’isolamento di LT-HSCs e ST-HSCs, uno studio che utilizza uno screening multi-step e imparziale ha identificato un singolo gene, Hoxb5, che è eterogeneamente espresso nella frazione pHSC16. Inoltre, l’analisi del midollo osseo dei topi reporter Hoxb5 ha rivelato che circa il 20% -25% della frazione pHSC è costituita da cellule Hoxb5 pos. Un test competitivo di trapianto utilizzando le pHSC Hoxb5 pos e le pHSC Hoxb5 neg ha rivelato che solo le pHSC Hoxb5pos possiedono una capacità di auto-rinnovamento a lungo termine, mentre le pHSC Hoxb5neg perdono la loro capacità di auto-rinnovamento entro un breve periodo, indicando che Hoxb5 identifica LT-HSC nella frazione pHSC16.
Qui, dimostriamo un protocollo passo-passo per isolare LT-HSC e ST-HSC utilizzando il sistema di reporter Hoxb5 . Inoltre, presentiamo un saggio di trapianto competitivo per valutare la capacità di auto-rinnovamento delle pHSC Hoxb5pos/neg (Figura 1). Questo sistema di reporter Hoxb5 ci consente di isolare prospetticamente LT-HSC e ST-HSC e contribuisce alla comprensione delle caratteristiche specifiche di LT-HSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tradizionalmente, le HSC definite dai marcatori di superficie cellulare sono state preparate per studiare le funzioni delle HSC, come la capacità di auto-rinnovamento e la multi-potenza 19,20,21. Tuttavia, la frazione HSC immunofenotipicamente definita (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) contiene due popolazioni HSC discrete: LT-HSCs e ST-H…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo con gratitudine Hiroshi Kiyonari per la cura degli animali e per aver fornito topi riceventi a RIKEN BDR, così come Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka e Masaki Miyahashi per la gestione del laboratorio presso l’Università di Kobe. Gli autori apprezzano molto anche il continuo supporto per questo lavoro. Masanori Miyanishi è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 e JP20H03268, dalla Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, dalla Life Science Foundation of Japan, dalla Takeda Science Foundation, dalla Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders e da AMED-PRIME, AMED con il numero di sovvenzione JP18gm6110020. Taro Sakamaki è supportato dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI JP21K20669 e JP22K16334 ed è stato supportato da il programma JSPS Core-to-Core e il programma RIKEN Junior Research Associate. Katsuyuki Nishi è stato supportato da JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.
Materials
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
Referências
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
- Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
- Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
- Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075 (2016).
- Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
- Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
- Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
- Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
- Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
- Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
- Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
- Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).
