Presentiamo un protocollo passo-passo per l’isolamento di cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs) e HSCs a breve termine (ST-HSCs) utilizzando il sistema reporter Hoxb5.
La capacità di auto-rinnovamento e il potenziale di differenziazione multi-lineage sono generalmente considerati come le caratteristiche distintive delle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Tuttavia, numerosi studi hanno suggerito che esiste eterogeneità funzionale nel compartimento HSC. Recenti analisi a singola cellula hanno riportato cloni HSC con diversi destini cellulari all’interno del compartimento HSC, che sono indicati come cloni HSC distorti. I meccanismi alla base di risultati eterogenei o scarsamente riproducibili sono poco compresi, soprattutto per quanto riguarda la durata dell’auto-rinnovamento quando le frazioni HSC purificate vengono trapiantate mediante immunocolorazione convenzionale. Pertanto, stabilire un metodo di isolamento riproducibile per le HSC a lungo termine (LT-HSC) e le HSC a breve termine (ST-HSC), definite dalla durata del loro auto-rinnovamento, è fondamentale per superare questo problema. Utilizzando uno screening imparziale multi-step, abbiamo identificato un fattore di trascrizione, Hoxb5, che potrebbe essere un marker esclusivo di LT-HSC nel sistema ematopoietico del topo. Sulla base di questa scoperta, abbiamo stabilito una linea di topi reporter Hoxb5 e isolato con successo LT-HSC e ST-HSC. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l’isolamento di LT-HSC e ST-HSC utilizzando il sistema di reporter Hoxb5 . Questo metodo di isolamento aiuterà i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi di auto-rinnovamento e le basi biologiche di tale eterogeneità nel compartimento HSC.
Le cellule staminali ematopoietiche (HSC), che possiedono capacità di auto-rinnovamento e multipotenza, risiedono all’apice della gerarchia ematopoietica 1,2. Nel 1988, Weissman e colleghi hanno dimostrato per la prima volta che l’isolamento delle HSC di topo potrebbe essere ottenuto utilizzando la citometria a flusso3. Successivamente, una frazione definita da una combinazione di marcatori di superficie cellulare, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, è stata riportata per contenere tutte le HSC nei topi 4,5,6,7,8.
Le HSCs immunofenotipicamente definite (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) (di seguito, pHSCs) sono state precedentemente considerate funzionalmente omogenee. Tuttavia, recenti analisi monocellulari hanno rivelato che le pHSC mostrano ancora eterogeneità rispetto alla loro capacità di auto-rinnovamento9,10 e multipotenza11,12. In particolare, nella frazione pHSC sembrano esistere due popolazioni per quanto riguarda la loro capacità di auto-rinnovamento: le cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs), che hanno una capacità di auto-rinnovamento continuo, e le cellule staminali ematopoietiche a breve termine (ST-HSCs), che hanno capacità transitorie di auto-rinnovamento 9,10.
Ad oggi, i meccanismi molecolari della capacità di auto-rinnovamento che distinguono LT-HSCs e ST-HSCs rimangono poco conosciuti. È fondamentale isolare entrambe le popolazioni cellulari in base alle loro capacità di auto-rinnovamento e scoprire i meccanismi molecolari sottostanti. Sono stati inoltre introdotti diversi sistemi di segnalazione per purificare LT-HSC13,14,15; tuttavia, la purezza LT-HSC definita da ciascun sistema reporter è variabile e la purificazione LT-HSC esclusiva non è stata raggiunta fino ad oggi.
Pertanto, lo sviluppo di un sistema di isolamento per LT-HSC e ST-HSC accelererà la ricerca sulla capacità di auto-rinnovamento nella frazione pHSC. Nell’isolamento di LT-HSCs e ST-HSCs, uno studio che utilizza uno screening multi-step e imparziale ha identificato un singolo gene, Hoxb5, che è eterogeneamente espresso nella frazione pHSC16. Inoltre, l’analisi del midollo osseo dei topi reporter Hoxb5 ha rivelato che circa il 20% -25% della frazione pHSC è costituita da cellule Hoxb5 pos. Un test competitivo di trapianto utilizzando le pHSC Hoxb5 pos e le pHSC Hoxb5 neg ha rivelato che solo le pHSC Hoxb5pos possiedono una capacità di auto-rinnovamento a lungo termine, mentre le pHSC Hoxb5neg perdono la loro capacità di auto-rinnovamento entro un breve periodo, indicando che Hoxb5 identifica LT-HSC nella frazione pHSC16.
Qui, dimostriamo un protocollo passo-passo per isolare LT-HSC e ST-HSC utilizzando il sistema di reporter Hoxb5 . Inoltre, presentiamo un saggio di trapianto competitivo per valutare la capacità di auto-rinnovamento delle pHSC Hoxb5pos/neg (Figura 1). Questo sistema di reporter Hoxb5 ci consente di isolare prospetticamente LT-HSC e ST-HSC e contribuisce alla comprensione delle caratteristiche specifiche di LT-HSC.
Tradizionalmente, le HSC definite dai marcatori di superficie cellulare sono state preparate per studiare le funzioni delle HSC, come la capacità di auto-rinnovamento e la multi-potenza 19,20,21. Tuttavia, la frazione HSC immunofenotipicamente definita (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) contiene due popolazioni HSC discrete: LT-HSCs e ST-H…
The authors have nothing to disclose.
Riconosciamo con gratitudine Hiroshi Kiyonari per la cura degli animali e per aver fornito topi riceventi a RIKEN BDR, così come Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka e Masaki Miyahashi per la gestione del laboratorio presso l’Università di Kobe. Gli autori apprezzano molto anche il continuo supporto per questo lavoro. Masanori Miyanishi è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 e JP20H03268, dalla Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, dalla Life Science Foundation of Japan, dalla Takeda Science Foundation, dalla Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders e da AMED-PRIME, AMED con il numero di sovvenzione JP18gm6110020. Taro Sakamaki è supportato dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI JP21K20669 e JP22K16334 ed è stato supportato da il programma JSPS Core-to-Core e il programma RIKEN Junior Research Associate. Katsuyuki Nishi è stato supportato da JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.
0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
30G insulin syringe | BD | 326668 | |
40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
Lysis buffer | BD | 555899 | |
MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |