通过免疫淘选富集成年小鼠背根神经节神经元培养物
Summary
本文描述了一种成年小鼠背根神经节的免疫平移方案。通过将抗体粘附到培养板上，我们可以负性地选择和去除非神经元细胞。我们表明，使用该协议为神经元富集培养物，从而可以深入研究神经元对操作的反应。
Abstract
背根神经节（DRGs）是与脊髓背角相邻的外围结构，容纳感觉神经元的细胞体以及各种其他细胞类型。已发表的培养方案通常将整个解离的DRG培养物称为神经元，尽管存在成纤维细胞，雪旺细胞，巨噬细胞和淋巴细胞。虽然这些完整的DRG培养物足以用于成像应用，其中可以根据形态或染色来识别神经元，但从这些培养物中收集的蛋白质或RNA匀浆主要不是神经元起源的。在这里，我们描述了培养小鼠DRG的免疫平移序列。该方法的目标是通过去除其他细胞类型来丰富神经元的DRG培养物。免疫淘选是指通过将抗体粘附到细胞培养皿中来去除细胞类型的方法。使用这些培养皿，我们可以消极地选择和减少培养物中成纤维细胞、免疫细胞和雪旺细胞的数量。这种方法使我们能够增加培养物中神经元的百分比。
Introduction
背根神经节（DRGs）容纳支配外周组织的感觉神经元的细胞体。研究这些神经元使我们能够理解疼痛和感觉状况的机制基础。然而，DRGs不仅由神经元组成，还包含成纤维细胞，雪旺细胞，巨噬细胞和其他免疫细胞1。尽管存在这些不同的细胞类型，但整个DRG培养物在文献中通常被称为神经元2，3。这些培养物仍然可用于通过成像或流式细胞术进行神经元研究，这将允许通过染色、细胞大小和/或形态进行神经元鉴定。然而，对于聚合酶链反应（PCR）或蛋白质印迹等检测，其中培养物均质化以进行RNA或蛋白质收集，非神经元细胞类型的存在可能会干扰结果。因此，需要增加DRG培养物中神经元细胞的比例。
免疫淘选是一种用于纯化各种细胞类型的技术，包括皮质神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞和小胶质细胞。简而言之，它涉及将针对细胞表面标志物的抗体粘附到培养皿上，旨在结合某些细胞（图1），并且可用于选择支持或反对感兴趣的细胞类型4，5，6。免疫淘选大鼠胚胎DRG以选择针对非神经元细胞，之前已由Zuchero7描述过。然而，我们一直无法找到特定于小鼠DRG的免疫淘选方案。在该协议中，我们以Zuchero协议的基本租户为基础，但改为调整免疫淘选序列以丰富成年小鼠DRG培养物（图2）。这是研究培养中已建立的感觉神经元的有力工具。它是有利的，因为它允许使用来自遗传，疾病和损伤模型的成年小鼠，以便可以更特异性地研究它们的感觉神经元。
该协议对于希望增加成年小鼠DRG培养物中神经元比例的读者是有利的。然而，免疫淘选步骤也可以省略，该方案也可用于整个DRG培养。
Protocol
Representative Results
Discussion
这种免疫平移方案增加了DRG原代培养物中神经元细胞的比例。为了获得最佳效果，应及时进行解剖，并应修剪多余的神经。解离步骤应仔细监测，不应超过1小时，以防止细胞受到不必要的压力。特别是关于免疫淘选，每个板应在中点轻轻旋转，以使细胞能够接触到包被的抗体。收集神经元细胞悬液后，还应在培养显微镜下观察平板，以确保非神经元细胞已结合。
使用成年小?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了加拿大卫生研究院的项目资助（FRN-162434）和加拿大MS协会的发现资助（EGID-3761）。作者要感谢孙博士和交叉癌症研究所对ImageXpress系统的培训和使用。
Materials
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
Referências
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