イムノパンニングによる成体マウス背根神経節培養の濃縮
Summary
この論文では、成体マウス後根神経節に対する免疫パンニングプロトコルについて説明します。培養プレートに抗体を接着させることで、非神経細胞をネガティブに選択して除去することができます。このプロトコルを使用して、培養がニューロンに濃縮されていることを示し、操作に対するニューロン応答の詳細な研究を可能にします。
Abstract
後根神経節(DRG)は、脊髄の背角に隣接する末梢構造であり、感覚ニューロンの細胞体やその他のさまざまな種類の細胞を収容しています。公表されている培養プロトコルでは、線維芽細胞、シュワン細胞、マクロファージ、リンパ球が存在するにもかかわらず、解離したDRG培養全体がニューロンであると言及されることがよくあります。これらのDRG培養物全体は、形態または染色に基づいてニューロンを識別できるイメージングアプリケーションには十分ですが、これらの培養物から収集されたタンパク質またはRNAホモジネートは、主にニューロン起源ではありません。ここでは、培養マウスDRGのイムノパンニング配列について述べる。この方法の目標は、他の細胞タイプを除去することによってニューロンのDRG培養を濃縮することです。イムノパニングとは、細胞培養皿に抗体を接着させて細胞型を除去する方法を指します。これらのディッシュを使用すると、培養中の線維芽細胞、免疫細胞、およびシュワン細胞に対してネガティブに選択し、数を減らすことができます。この方法では、培養中のニューロンの割合を増やすことができます。
Introduction
背側根神経節(DRG)は、末梢組織を神経支配する感覚ニューロンの細胞体を収容します。これらのニューロンを研究することで、痛みや感覚状態の機構的基盤を理解することができます。しかし、DRGはニューロンのみから構成されるのではなく、線維芽細胞、シュワン細胞、マクロファージなどの免疫細胞も含んでいます1。これらの様々な細胞型が存在するにもかかわらず、DRG培養物全体は、文献ではニューロン2,3と呼ばれることが多い。これらの培養は、イメージングまたはフローサイトメトリーによるニューロンの調査に依然として有用であり、染色、細胞サイズ、および/または形態によるニューロンの同定を可能にします。ただし、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)やウェスタンブロッティングなどのアッセイでは、RNAまたはタンパク質収集のために培養物をホモジナイズするため、非神経細胞型の存在が結果を妨げる可能性があります。したがって、DRG培養における神経細胞の割合を増やす必要があります。
イムノパニングは、皮質ニューロン、星状細胞、希突起膠細胞前駆細胞、ミクログリアなど、さまざまな種類の細胞を精製するために使用される技術です。簡単に言えば、特定の細胞に結合することを目的としたペトリ皿に細胞表面マーカーに対する抗体を接着することを含み(図1)、目的の細胞タイプに対してまたは反対のいずれかを選択するために使用できます4、5、6。非神経細胞に対して選択するイムノパニングラット胚性DRGsは、Zuchero7によって以前に記載されている。しかし、マウスDRGに特異的なイムノパンニングプロトコルは見つかっていませんでした。このプロトコルでは、Zucheroプロトコルの基本的なテナントに基づいて構築しますが、代わりにイムノパンニングシーケンスを適応させて成体マウスDRG培養を濃縮します(図2)。これは、培養において確立された感覚ニューロンを研究するための強力なツールです。遺伝的、疾患、および損傷モデルからの成体マウスの使用を可能にするので、それらの感覚ニューロンをより特異に研究することができるので有利である。
このプロトコルは、成体マウスDRG培養におけるニューロンの割合を増加させようとしている読者にとって有利です。ただし、イムノパニングステップを省略することもでき、このプロトコルはDRG培養全体にも使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このイムノパニングプロトコルは、DRG初代培養における神経細胞の割合を増加させます。最良の結果を得るには、解剖を適時に行い、DRGから余分な神経を取り除く必要があります。解離ステップは注意深く監視されるべきであり、細胞が不必要なストレスから生じるのを防ぐために1時間を超えてはならない。特にイムノパンニングに関しては、細胞がコーティングされた抗体にアクセスでき…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カナダ健康研究所からのプロジェクト助成金(FRN-162434)とカナダMS協会からのディスカバリー助成金(EGID-3761)によってサポートされました。著者らは、ImageXpressシステムのトレーニングと使用について、Sun博士とCross Cancer Instituteに感謝したい。
Materials
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
Referências
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- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
