면역패닝에 의한 성체 마우스 배근 신경절 뉴런 배양의 농축
Summary
이 논문은 성인 마우스 후근 신경절에 대한 면역 패닝 프로토콜을 설명합니다. 배양 플레이트에 항체를 부착함으로써 비신경 세포를 음성으로 선택하고 제거할 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 뉴런에 대한 배양이 풍부해짐을 보여주며, 조작에 대한 뉴런 반응에 대한 심층 연구를 가능하게 합니다.
Abstract
등근 신경절(DRG)은 척수의 등쪽 뿔에 인접한 말초 구조로, 감각 뉴런의 세포체와 다양한 기타 세포 유형을 수용합니다. 공개된 배양 프로토콜은 종종 섬유아세포, 슈반 세포, 대식세포 및 림프구의 존재에도 불구하고 전체 해리된 DRG 배양을 뉴런으로 언급합니다. 이러한 전체 DRG 배양은 형태 또는 염색을 기반으로 뉴런을 식별할 수 있는 이미징 응용 분야에 충분하지만, 이러한 배양에서 수집된 단백질 또는 RNA 균질액은 주로 뉴런 기원이 아닙니다. 여기서는 배양된 마우스 DRG에 대한 면역패닝 서열을 설명합니다. 이 방법의 목표는 다른 세포 유형을 제거하여 뉴런에 대한 DRG 배양을 풍부하게 하는 것입니다. 면역패닝은 항체를 세포배양접시에 부착시켜 세포형을 제거하는 방법을 말한다. 이 접시를 사용하여 우리는 배양에서 섬유아세포, 면역 세포 및 슈반 세포의 수를 부정적으로 선택하고 줄일 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 배양에서 뉴런의 비율을 높일 수 있습니다.
Introduction
등근 신경절(DRG)은 말초 조직을 자극하는 감각 뉴런의 세포체를 수용합니다. 이러한 뉴런을 연구하면 통증과 감각 상태의 기계론적 토대를 이해할 수 있습니다. 그러나 DRG는 뉴런만으로 구성되는 것이 아니라 섬유아세포, 슈반 세포, 대식세포 및 기타 면역 세포도 포함합니다1. 이러한 다양한 세포 유형의 존재에도 불구하고, 전체 DRG 배양물은 종종 문헌에서 뉴런 2,3으로 지칭된다. 이러한 배양은 이미징 또는 유세포 분석에 의한 신경 세포 조사에 여전히 유용하며, 이를 통해 염색, 세포 크기 및/또는 형태에 의한 신경 식별이 가능합니다. 그러나 RNA 또는 단백질 수집을 위해 배양물을 균질화하는 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 웨스턴 블로팅과 같은 분석의 경우 비뉴런 세포 유형의 존재가 결과를 방해할 수 있습니다. 따라서 DRG 배양에서 신경 세포의 비율을 증가시킬 필요가 있습니다.
면역패닝은 피질 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포 전구체 세포 및 미세아교세포를 포함한 다양한 세포 유형을 정제하는 데 사용되는 기술입니다. 간단히 말해서, 특정 세포에 결합하기 위한 페트리 접시에 세포 표면 마커에 대한 항체를 부착하는 것을 포함하며(그림 1), 관심 있는 세포 유형을 선택하거나 반대하는 데 사용할 수 있습니다 4,5,6. 비뉴런 세포에 대해 선택하기 위한 면역패닝 쥐 배아 DRG는 이전에 Zuchero7에 의해 설명되었습니다. 그러나 마우스 DRG에 특정한 면역패닝 프로토콜을 찾을 수 없었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 Zuchero 프로토콜의 기본 테넌트를 기반으로 하지만 대신 면역 패닝 서열을 조정하여 성인 마우스 DRG 배양을 풍부하게 했습니다(그림 2). 이것은 배양에서 확립된 감각 뉴런을 연구하는 강력한 도구입니다. 유전, 질병 및 손상 모델의 성인 마우스를 사용할 수 있으므로 감각 뉴런을 더 특이적으로 연구할 수 있으므로 유리합니다.
이 프로토콜은 성인 마우스 DRG 배양에서 뉴런의 비율을 증가시키려는 독자에게 유리합니다. 그러나, 면역패닝 단계는 또한 생략될 수 있고, 이 프로토콜은 또한 전체 DRG 배양에 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 면역패닝 프로토콜은 DRG 일차 배양에서 신경 세포의 비율을 증가시킵니다. 최상의 결과를 얻으려면 적시에 해부를 수행해야하며 DRG는 과도한 신경을 잘라야합니다. 해리 단계는 주의 깊게 모니터링해야 하며 세포가 불필요한 스트레스를 받지 않도록 1시간을 초과해서는 안 됩니다. 구체적으로 면역패닝과 관련하여, 각 플레이트는 세포가 코팅된 항체에 접근할 수 있도록 중간 지점에서 부드?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 캐나다 보건 연구소 (FRN-162434)의 프로젝트 보조금과 캐나다 MS 협회 (EGID-3761)의 디스커버리 보조금으로 지원되었습니다. 저자는 ImageXpress 시스템의 교육과 사용에 대해 Sun 박사와 Cross Cancer Institute에 감사드립니다.
Materials
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
Referências
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 271 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Biologia do Desenvolvimento. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
