Enriquecimento de Culturas de Neurônios de Gânglios da Raiz Dorsal de Camundongos Adultos por Immunopanning
Summary
Este trabalho descreve um protocolo de immunopanning para gânglios da raiz dorsal de camundongos adultos. Ao aderir anticorpos às placas de cultura, podemos selecionar e remover negativamente as células não neuronais. Mostramos que as culturas são enriquecidas para neurônios usando este protocolo, permitindo um estudo aprofundado das respostas neuronais à manipulação.
Abstract
Gânglios da raiz dorsal (DRGs) são estruturas periféricas adjacentes ao corno dorsal da medula espinhal, que abrigam os corpos celulares dos neurônios sensoriais, bem como vários outros tipos celulares. Os protocolos de cultura publicados frequentemente se referem a culturas de DRG dissociadas inteiras como sendo neuronais, apesar da presença de fibroblastos, células de Schwann, macrófagos e linfócitos. Embora essas culturas DRG inteiras sejam suficientes para aplicações de imagem onde os neurônios podem ser discernidos com base na morfologia ou coloração, homogeneizados de proteína ou RNA coletados dessas culturas não são primariamente de origem neuronal. Aqui, descrevemos uma sequência de immunopanning para DRGs de camundongos cultivados. O objetivo deste método é enriquecer culturas DRG para neurônios, removendo outros tipos celulares. Immunopanning refere-se a um método de remoção de tipos celulares por adesão de anticorpos a placas de cultura celular. Usando esses pratos, podemos selecionar negativamente e reduzir o número de fibroblastos, células imunes e células de Schwann em cultura. Este método nos permite aumentar a porcentagem de neurônios em culturas.
Introduction
Os gânglios da raiz dorsal (DRGs) abrigam os corpos celulares dos neurônios sensoriais que inervam os tecidos periféricos. O estudo desses neurônios nos permite entender os fundamentos mecanicistas da dor e das condições sensoriais. No entanto, os DRGs não são compostos apenas por neurônios, mas também contêm fibroblastos, células de Schwann, macrófagos e outras células imunes1. Apesar da presença desses vários tipos celulares, culturas completas de DRG são frequentemente referidas na literatura comoneuronais2,3. Essas culturas ainda são úteis para investigação neuronal por imagem ou citometria de fluxo, o que permitiria a identificação neuronal por coloração, tamanho celular e/ou morfologia. Entretanto, para ensaios como a reação em cadeia da polimerase (PCR) ou western blotting, em que as culturas são homogeneizadas para coleta de RNA ou proteína, a presença de tipos celulares não neuronais pode interferir nos resultados. Assim, há necessidade de aumentar a proporção de células neuronais em culturas DRG.
O immunopanning é uma técnica usada para purificar uma variedade de tipos celulares, incluindo neurônios corticais, astrócitos, células precursoras de oligodendrócitos e micróglia. Em palavras simples, trata-se da adesão de um anticorpo contra um marcador de superfície celular a uma placa de Petri, destinado a ligar determinadas células (Figura 1), e pode ser usado para selecionar a favor ou contra tipos celulares de interesse4,5,6. DRGs embrionários de ratos imunopanning para selecionar contra células não neuronais foi descrito anteriormente por Zuchero7. No entanto, não conseguimos encontrar um protocolo de immunopanning específico para DRGs de camundongos. Neste protocolo, nos baseamos nos inquilinos básicos do protocolo Zuchero, mas adaptamos a sequência de immunopanning para enriquecer culturas DRG de camundongos adultos (Figura 2). Esta é uma ferramenta poderosa para estudar neurônios sensoriais estabelecidos em cultura. É vantajoso, pois permite o uso de camundongos adultos a partir de modelos genéticos, de doenças e lesões, para que seus neurônios sensoriais possam ser estudados com maior especificidade.
Este protocolo é vantajoso para leitores que procuram aumentar a proporção de neurônios em culturas DRG de camundongos adultos. No entanto, as etapas de immunopanning também podem ser omitidas, e esse protocolo também pode ser usado para culturas de DRG inteiras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo de immunopanning aumenta a proporção de células neuronais em culturas primárias DRG. Para obter os melhores resultados, as dissecções devem ser feitas em tempo hábil, e os DRGs devem ser cortados do excesso de nervos. A etapa de dissociação deve ser cuidadosamente monitorada, e não deve exceder 1 h, para evitar que as células sofram estresse desnecessário. No que diz respeito especificamente ao immunopanning, cada placa deve ser girada suavemente no ponto médio para permitir que as células te…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa de Projeto dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (FRN-162434) e uma Bolsa de Descoberta da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá (EGID-3761). Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Sun e ao Cross Cancer Institute pelo treinamento e uso do sistema ImageXpress.
Materials
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
Referências
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