إثراء مزارع الخلايا العصبية للعقد الجذرية الظهرية للفأر البالغ عن طريق التحفيز المناعي
Summary
تصف هذه الورقة بروتوكول منااعي للعقد الجذرية الظهرية للفأر البالغ. من خلال لصق الأجسام المضادة بألواح الثقافة ، يمكننا اختيار الخلايا غير العصبية وإزالتها بشكل سلبي. نظهر أن الثقافات يتم إثراؤها للخلايا العصبية باستخدام هذا البروتوكول ، مما يسمح بإجراء دراسة متعمقة للاستجابات العصبية للتلاعب.
Abstract
العقد الجذرية الظهرية (DRGs) هي هياكل طرفية مجاورة للقرن الظهري للحبل الشوكي ، والتي تضم أجسام الخلايا العصبية الحسية بالإضافة إلى أنواع مختلفة من الخلايا الأخرى. غالبا ما تشير بروتوكولات الثقافة المنشورة إلى ثقافات DRG المنفصلة بالكامل على أنها خلايا عصبية ، على الرغم من وجود الخلايا الليفية وخلايا شوان والبلاعم والخلايا الليمفاوية. في حين أن ثقافات DRG بأكملها كافية لتطبيقات التصوير حيث يمكن تمييز الخلايا العصبية بناء على التشكل أو التلوين ، فإن تجانسات البروتين أو الحمض النووي الريبي التي تم جمعها من هذه الثقافات ليست عصبية في الأصل في المقام الأول. هنا ، نصف تسلسل المناعة ل DRGs الفئران المستزرعة. الهدف من هذه الطريقة هو إثراء ثقافات DRG للخلايا العصبية عن طريق إزالة أنواع الخلايا الأخرى. يشير Immunopanning إلى طريقة لإزالة أنواع الخلايا عن طريق لصق الأجسام المضادة بأطباق زراعة الخلايا. باستخدام هذه الأطباق ، يمكننا الاختيار السلبي وتقليل عدد الخلايا الليفية والخلايا المناعية وخلايا شوان في الثقافة. تسمح لنا هذه الطريقة بزيادة نسبة الخلايا العصبية في الثقافات.
Introduction
تضم العقد الجذرية الظهرية (DRGs) أجسام الخلايا العصبية الحسية التي تعصب الأنسجة المحيطية. تسمح لنا دراسة هذه الخلايا العصبية بفهم الأسس الميكانيكية للألم والظروف الحسية. ومع ذلك ، لا تتكون DRGs من الخلايا العصبية وحدها ، ولكنها تحتوي أيضا على الخلايا الليفية وخلايا Schwann والبلاعم والخلايا المناعية الأخرى1. على الرغم من وجود هذه الأنواع المختلفة من الخلايا ، غالبا ما يشار إلى ثقافات DRG بأكملها في الأدبيات باسم الخلايا العصبية 2,3. لا تزال هذه الثقافات مفيدة للتحقيق العصبي عن طريق التصوير أو قياس التدفق الخلوي ، مما يسمح بتحديد الخلايا العصبية عن طريق التلوين و / أو حجم الخلية و / أو التشكل. ومع ذلك ، بالنسبة للمقايسات مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو النشاف الغربي ، حيث يتم تجانس الثقافات لجمع الحمض النووي الريبي أو البروتين ، قد يتداخل وجود أنواع الخلايا غير العصبية مع النتائج. وبالتالي ، هناك حاجة لزيادة نسبة الخلايا العصبية في مزارع DRG.
Immunopanning هي تقنية تستخدم لتنقية مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية القشرية ، والخلايا النجمية ، وخلايا سلائف oligodendrocyte ، والخلايا الدبقية الصغيرة. بكلمات بسيطة ، يتضمن لصق جسم مضاد ضد علامة سطح الخلية بطبق بتري ، يهدف إلى ربط خلايا معينة (الشكل 1) ، ويمكن استخدامه لتحديد إما مع أو ضد أنواع الخلايا ذات الأهمية4،5،6. تم وصف DRGs الجنينية للفئران المناعية للاختيار ضد الخلايا غير العصبية سابقا بواسطة Zuchero7. ومع ذلك ، لم نتمكن من العثور على بروتوكول مناعي خاص ب DRGs للماوس. في هذا البروتوكول ، نبني على المستأجرين الأساسيين لبروتوكول Zuchero ، ولكن بدلا من ذلك قمنا بتكييف تسلسل المناعة لإثراء ثقافات DRG للفأر البالغ (الشكل 2). هذه أداة قوية لدراسة الخلايا العصبية الحسية الراسخة في الثقافة. إنه مفيد لأنه يسمح باستخدام الفئران البالغة من النماذج الوراثية والمرضية والإصابات ، بحيث يمكن دراسة الخلايا العصبية الحسية الخاصة بهم بمزيد من التحديد.
هذا البروتوكول مفيد للقراء الذين يتطلعون إلى زيادة نسبة الخلايا العصبية في مزارع DRG للفأر البالغ. ومع ذلك ، يمكن أيضا حذف خطوات المناعة ، ويمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لثقافات DRG بأكملها.
Protocol
Representative Results
Discussion
يزيد بروتوكول المناعة هذا من نسبة الخلايا العصبية في الثقافات الأولية DRG. للحصول على أفضل النتائج ، يجب إجراء التشريح في الوقت المناسب ، ويجب تقليم DRGs من الأعصاب الزائدة. يجب مراقبة خطوة التفكك بعناية ، ويجب ألا تتجاوز 1 ساعة ، لمنع الخلايا من الإجهاد غير الضروري. فيما يتعلق بالمناعة على وج?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة مشروع من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (FRN-162434) ومنحة اكتشاف من جمعية التصلب المتعدد الكندية (EGID-3761). يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور صن ومعهد الصليب للسرطان على التدريب واستخدام نظام ImageXpress.
Materials
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
Referências
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 271 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Biologia do Desenvolvimento. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
