Berigelse af voksne musedorsalrodganglier neuronkulturer ved immunpanorering
Summary
Dette papir beskriver en immunpanoreringsprotokol for voksne musedorsalrodsganglier. Ved at klæbe antistoffer til dyrkningsplader kan vi negativt vælge og fjerne ikke-neuronale celler. Vi viser, at kulturerne er beriget for neuroner ved hjælp af denne protokol, hvilket giver mulighed for en dybdegående undersøgelse af neuronale reaktioner på manipulation.
Abstract
Dorsalrodsganglier (DRG’er) er perifere strukturer ved siden af rygmarvens dorsale horn, som huser cellelegemerne i sensoriske neuroner såvel som forskellige andre celletyper. Offentliggjorte kulturprotokoller henviser ofte til hele dissocierede DRG-kulturer som neuronale på trods af tilstedeværelsen af fibroblaster, Schwann-celler, makrofager og lymfocytter. Mens hele disse DRG-kulturer er tilstrækkelige til billeddannelsesapplikationer, hvor neuroner kan skelnes baseret på morfologi eller farvning, er protein- eller RNA-homogenater indsamlet fra disse kulturer ikke primært neuronal oprindelse. Her beskriver vi en immunpanoreringssekvens for dyrkede muse-DRG’er. Målet med denne metode er at berige DRG-kulturer for neuroner ved at fjerne andre celletyper. Immunopanning refererer til en metode til fjernelse af celletyper ved at klæbe antistoffer til cellekulturskåle. Ved hjælp af disse retter kan vi negativt vælge imod og reducere antallet af fibroblaster, immunceller og Schwann-celler i kultur. Denne metode giver os mulighed for at øge procentdelen af neuroner i kulturer.
Introduction
Dorsalrodsganglier (DRG’er) huser cellelegemerne i de sensoriske neuroner, som inderverer perifert væv. At studere disse neuroner giver os mulighed for at forstå det mekanistiske grundlag for smerte og sensoriske tilstande. DRG’er består imidlertid ikke af neuroner alene, men indeholder også fibroblaster, Schwann-celler, makrofager og andre immunceller1. På trods af tilstedeværelsen af disse forskellige celletyper omtales hele DRG-kulturer ofte i litteraturen som neuronal 2,3. Disse kulturer er stadig nyttige til neuronal undersøgelse ved billeddannelse eller flowcytometri, hvilket ville muliggøre neuronal identifikation ved farvning, cellestørrelse og / eller morfologi. For assays såsom polymerasekædereaktion (PCR) eller western blotting, hvor kulturer homogeniseres til RNA- eller proteinindsamling, kan tilstedeværelsen af ikke-neuronale celletyper imidlertid interferere med resultaterne. Derfor er der behov for at øge andelen af neuronale celler i DRG-kulturer.
Immunopanning er en teknik, der bruges til at rense en række celletyper, herunder kortikale neuroner, astrocytter, oligodendrocytprecursorceller og mikroglia. Med enkle ord involverer det at klæbe et antistof mod en celleoverflademarkør til en petriskål, beregnet til at binde visse celler (figur 1), og det kan bruges til at vælge enten for eller imod celletyper af interesse 4,5,6. Immunopanning rotte embryonale DRG’er til at vælge mod ikke-neuronale celler er tidligere blevet beskrevet af Zuchero7. Vi har dog ikke været i stand til at finde en immunpanoreringsprotokol, der er specifik for DRG’er til mus. I denne protokol bygger vi videre på Zuchero-protokollens grundlæggende lejere, men tilpassede i stedet immunpanoreringssekvensen for at berige DRG-kulturer med voksne mus (figur 2). Dette er et kraftfuldt værktøj til at studere etablerede sensoriske neuroner i kultur. Det er fordelagtigt, da det giver mulighed for brug af voksne mus fra genetiske, sygdoms- og skademodeller, så deres sensoriske neuroner kan studeres med større specificitet.
Denne protokol er fordelagtig for læsere, der ønsker at øge andelen af neuroner i DRG-kulturer med voksne mus. Imidlertid kan immunpanningstrinnene også udelades, og denne protokol kan også bruges til hele DRG-kulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne immunpanningsprotokol øger andelen af neuronale celler i DRG-primære kulturer. For de bedste resultater skal dissektioner udføres rettidigt, og DRG’er skal trimmes af overskydende nerver. Dissociationstrinnet skal overvåges nøje og bør ikke overstige 1 time for at forhindre cellerne i unødvendig stress. Med hensyn til immunpanorering specifikt skal hver plade forsigtigt hvirvles halvvejs for at give cellerne adgang til de overtrukne antistoffer. Pladerne skal også ses under et dyrkningsmikroskop, efter at n…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et projekttilskud fra Canadian Institutes of Health Research (FRN-162434) og et Discovery Grant fra MS Society of Canada (EGID-3761). Forfatterne vil gerne takke Dr. Sun og Cross Cancer Institute for træning og brug af ImageXpress-systemet.
Materials
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
Referências
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 271 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Biologia do Desenvolvimento. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
