Anreicherung von adulten Dorsalwurzelganglien-Neuronenkulturen der adulten Maus durch Immunpanning
Summary
In dieser Arbeit wird ein Immunpanning-Protokoll für adulte dorsale Wurzelganglien der Maus beschrieben. Durch das Anhaften von Antikörpern an Kulturplatten können wir nicht-neuronale Zellen negativ selektieren und entfernen. Wir zeigen, dass die Kulturen mit diesem Protokoll für Neuronen angereichert werden, was eine eingehende Untersuchung der neuronalen Reaktionen auf Manipulation ermöglicht.
Abstract
Dorsale Wurzelganglien (DRGs) sind periphere Strukturen, die an das Hinterhorn des Rückenmarks angrenzen und die Zellkörper sensorischer Neuronen sowie verschiedene andere Zelltypen beherbergen. In veröffentlichten Kulturprotokollen werden ganze dissoziierte DRG-Kulturen oft als neuronal bezeichnet, obwohl Fibroblasten, Schwann-Zellen, Makrophagen und Lymphozyten vorhanden sind. Während diese ganzen DRG-Kulturen für bildgebende Anwendungen ausreichen, bei denen Neuronen anhand der Morphologie oder der Färbung unterschieden werden können, sind Protein- oder RNA-Homogenate, die aus diesen Kulturen gewonnen werden, nicht primär neuronalen Ursprungs. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Immunpanning-Sequenz für kultivierte Maus-DRGs. Ziel dieser Methode ist es, DRG-Kulturen für Neuronen anzureichern, indem andere Zelltypen entfernt werden. Immunopanning bezieht sich auf eine Methode zur Entfernung von Zelltypen durch Anhaften von Antikörpern an Zellkulturschalen. Mit diesen Schalen können wir negativ selektieren und die Anzahl der Fibroblasten, Immunzellen und Schwann-Zellen in Kultur reduzieren. Diese Methode ermöglicht es uns, den Anteil der Neuronen in Kulturen zu erhöhen.
Introduction
Dorsale Wurzelganglien (DRGs) beherbergen die Zellkörper der sensorischen Neuronen, die periphere Gewebe innervieren. Die Untersuchung dieser Neuronen ermöglicht es uns, die mechanistischen Grundlagen von Schmerz und sensorischen Bedingungen zu verstehen. DRGs bestehen jedoch nicht nur aus Neuronen, sondern enthalten auch Fibroblasten, Schwann-Zellen, Makrophagen und andere Immunzellen1. Trotz des Vorhandenseins dieser verschiedenen Zelltypen werden ganze DRG-Kulturen in der Literatur oft als neuronalbezeichnet 2,3. Diese Kulturen sind nach wie vor nützlich für neuronale Untersuchungen durch Bildgebung oder Durchflusszytometrie, die eine neuronale Identifizierung durch Färbung, Zellgröße und/oder Morphologie ermöglichen würden. Bei Assays wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder dem Western-Blotting, bei denen Kulturen für die RNA- oder Proteinsammlung homogenisiert werden, kann jedoch das Vorhandensein nicht-neuronaler Zelltypen die Ergebnisse beeinträchtigen. Daher besteht die Notwendigkeit, den Anteil neuronaler Zellen in DRG-Kulturen zu erhöhen.
Immunopanning ist eine Technik, die zur Reinigung einer Vielzahl von Zelltypen verwendet wird, darunter kortikale Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und Mikroglia. In einfachen Worten handelt es sich um das Aufkleben eines Antikörpers gegen einen Zelloberflächenmarker an eine Petrischale, der bestimmte Zellen binden soll (Abbildung 1), und er kann verwendet werden, um entweder für oder gegen Zelltypen von Interesse zu selektieren 4,5,6. Das Immunpanning embryonaler DRGs von Ratten zur Selektion gegen nicht-neuronale Zellen wurde bereits von Zuchero7 beschrieben. Wir konnten jedoch kein spezifisches Immunpanning-Protokoll für Maus-DRGs finden. In diesem Protokoll bauen wir auf den Grundprinzipien des Zuchero-Protokolls auf, passen aber stattdessen die Immunpanning-Sequenz an, um DRG-Kulturen adulter Mäuse anzureichern (Abbildung 2). Dies ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um etablierte sensorische Neuronen in Kultur zu untersuchen. Dies ist vorteilhaft, da es die Verwendung von erwachsenen Mäusen aus Genetik-, Krankheits- und Verletzungsmodellen ermöglicht, so dass ihre sensorischen Neuronen mit größerer Spezifität untersucht werden können.
Dieses Protokoll ist vorteilhaft für Leser, die den Anteil der Neuronen in DRG-Kulturen adulter Mäuse erhöhen möchten. Die Schritte des Immunpannings können jedoch auch weggelassen werden, und dieses Protokoll kann auch für ganze DRG-Kulturen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Immunpanning-Protokoll erhöht den Anteil neuronaler Zellen in DRG-Primärkulturen. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollten Dissektionen rechtzeitig durchgeführt und DRGs von überschüssigen Nerven befreit werden. Der Dissoziationsschritt sollte sorgfältig überwacht werden und 1 Stunde nicht überschreiten, um die Zellen vor unnötigem Stress zu schützen. Speziell im Hinblick auf das Immunopanning sollte jede Platte auf halbem Weg vorsichtig geschwenkt werden, damit die Zellen Zugang zu den beschichtete…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Projektzuschuss der Canadian Institutes of Health Research (FRN-162434) und einen Discovery Grant der MS Society of Canada (EGID-3761) unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Dr. Sun und dem Cross Cancer Institute für die Schulung und Nutzung des ImageXpress-Systems.
Materials
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
Referências
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 271 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Biologia do Desenvolvimento. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
