Обогащение культур нейронов ганглиев дорсальных корешков взрослых мышей методом иммунопаннирования
Summary
В данной статье описывается протокол иммунопанирования для ганглиев дорсальных корешков взрослых мышей. Прикрепляя антитела к культуральным пластинам, мы можем отрицательно отбирать и удалять ненейрональные клетки. Мы показываем, что культуры обогащены для нейронов с использованием этого протокола, что позволяет углубленно изучить нейронные реакции на манипуляции.
Abstract
Ганглии дорсальных корешков (DRG) представляют собой периферические структуры, прилегающие к дорсальному рогу спинного мозга, в которых находятся клеточные тела сенсорных нейронов, а также различных других типов клеток. Опубликованные протоколы культивирования часто ссылаются на целые диссоциированные культуры DRG как на нейроны, несмотря на наличие фибробластов, шванновских клеток, макрофагов и лимфоцитов. В то время как эти целые культуры DRG достаточны для приложений визуализации, где нейроны могут быть различимы на основе морфологии или окрашивания, гомогенаты белка или РНК, собранные из этих культур, не являются в первую очередь нейрональными по происхождению. Здесь мы описываем последовательность иммунопанирования для культивируемых DRG мышей. Целью этого метода является обогащение культур DRG для нейронов путем удаления других типов клеток. Иммунопаннирование относится к методу удаления типов клеток путем прилипания антител к чашкам для клеточных культур. Используя эти чашки, мы можем отрицательно отбирать и уменьшать количество фибробластов, иммунных клеток и шванновских клеток в культуре. Этот метод позволяет увеличить процент нейронов в культурах.
Introduction
Ганглии дорсальных корешков (DRG) содержат клеточные тела сенсорных нейронов, которые иннервируют периферические ткани. Изучение этих нейронов позволяет нам понять механистические основы боли и сенсорных состояний. Однако DRG состоят не только из нейронов, но также содержат фибробласты, шванновские клетки, макрофаги и другие иммунные клетки1. Несмотря на наличие этих различных типов клеток, целые культуры DRG часто упоминаются в литературе как нейрональные 2,3. Эти культуры по-прежнему полезны для исследования нейронов с помощью визуализации или проточной цитометрии, что позволило бы идентифицировать нейроны путем окрашивания, размера клеток и / или морфологии. Однако для таких анализов, как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или вестерн-блоттинг, где культуры гомогенизируются для сбора РНК или белка, присутствие ненейрональных типов клеток может повлиять на результаты. Следовательно, необходимо увеличить долю нейрональных клеток в культурах DRG.
Иммунопаннирование — это метод, используемый для очистки различных типов клеток, включая корковые нейроны, астроциты, клетки-предшественники олигодендроцитов и микроглию. Проще говоря, он включает в себя прилипание антитела против маркера клеточной поверхности к чашке Петри, предназначенного для связывания определенных клеток (рис. 1), и его можно использовать для выбора либо за, либо против интересующих типов клеток 4,5,6. Иммунопанирование эмбриональных DRG крыс для отбора против ненейрональных клеток было описано ранее Zuchero7. Тем не менее, нам не удалось найти протокол иммунопанирования, специфичный для DRG мышей. В этом протоколе мы опираемся на основные арендаторы протокола Zuchero, но вместо этого адаптировали последовательность иммунопаннирования для обогащения культур DRG взрослых мышей (рис. 2). Это мощный инструмент для изучения установленных сенсорных нейронов в культуре. Это выгодно, поскольку позволяет использовать взрослых мышей из генетических моделей, моделей болезней и травм, так что их сенсорные нейроны могут быть изучены с большей специфичностью.
Этот протокол полезен для читателей, желающих увеличить долю нейронов в культурах DRG взрослых мышей. Тем не менее, этапы иммунопанирования также могут быть опущены, и этот протокол также может быть использован для целых культур DRG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол иммунопанирования увеличивает долю нейрональных клеток в первичных культурах DRG. Для достижения наилучшего результата следует своевременно проводить вскрытия, а ДРГ очищать от лишних нервов. Стадия диссоциации должна тщательно контролироваться и не должна превышать 1 ч…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана проектным грантом Канадского института исследований в области здравоохранения (FRN-162434) и грантом на открытие от Канадского общества рассеянного склероза (EGID-3761). Авторы выражают благодарность доктору Сану и Институту рака Кросса за обучение и использование системы ImageXpress.
Materials
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
Referências
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 271 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Biologia do Desenvolvimento. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
