Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה של מיטופגיה עם צבעים פלואורסצנטיים למיטוכונדריה וליזוזום

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64647
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1, 1, 1,2
1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 3Department of Pharmacy, Shanghai East Hospital, Tongji University

Summary

מיטופגיה היא המנגנון העיקרי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית. עם זאת, ההערכה של mitophagy in vivo הוא הפריע על ידי היעדר בדיקות כמותיות אמין. מוצג כאן פרוטוקול לתצפית על מיטופגיה בתאים חיים באמצעות צבע מיטוכונדריה ירוק-פלואורסצנטי המיועד לתאים וצבע ליזוזום אדום-פלואורסצנטי.

Abstract

מיטוכונדריה, בהיותה תחנות הכוח של התא, ממלאת תפקידים חשובים בביו-אנרגיה, יצירת רדיקלים חופשיים, הומאוסטזיס סידן ואפופטוזיס. מיטופגיה היא המנגנון העיקרי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית והיא נחקרת בדרך כלל באמצעות תצפית מיקרוסקופית, אולם מבחני מיטופגיה in vivo קשים לביצוע. הערכת מיטופגיה על ידי הדמיית אברונים חיים היא שיטה חלופית והכרחית למחקר מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים לשימוש בצבע המיטוכונדריה הירוק-פלואורסצנטי של התאים MitoTracker Green ובצבע הליזוזום האדום-פלואורסצנטי LysoTracker Red בתאים חיים, כולל העמסת הצבעים, הדמיה של המיטוכונדריה והליזוזום, והתוצאות הצפויות. שלבים מפורטים להערכת mitophagy בתאים חיים, כמו גם הערות טכניות על הגדרות תוכנה מיקרוסקופ, מסופקים גם. שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים לצפות במיטופגיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים. בנוסף, ניתן להשתמש בו כדי לכמת מיטוכונדריה וליזוזומים ולהעריך מורפולוגיה מיטוכונדריאלית.

Introduction

מיטוכונדריה הם תחנות הכוח של כמעט כל התאים האאוקריוטים 1,2. בנוסף לייצור ATP באמצעות פוספורילציה חמצונית, המיטוכונדריה ממלאת תפקיד חיוני בתהליכים אחרים כגון ביו-אנרגיה, הומאוסטזיס סידן, יצירת רדיקלים חופשיים, אפופטוזיס והומאוסטזיס תאי 3,4,5. כאשר המיטוכונדריה מייצרת מיני חמצן תגובתי (ROS) ממספר קומפלקסים בשרשרת הובלת האלקטרונים, הם מגורה כל הזמן על ידי עקה חמצונית פוטנציאלית, מה שעלול להוביל בסופו של דבר לנזק מבני ולתפקוד לקוי כאשר מערכת ההגנה נוגדת החמצון קורסת 6,7. נמצא כי תפקוד לקוי של המיטוכונדריה תורם למחלות רבות, כולל הפרעות מטבוליות, ניוון עצבי ומחלות לב וכלי דם8. לכן, חיוני לשמור על אוכלוסיות מיטוכונדריאליות בריאות ועל תפקודן התקין. מיטוכונדריה הם אברונים פלסטיים ודינמיים מאוד; המורפולוגיה והתפקוד שלהם נשלטים על ידי מנגנוני בקרת איכות מיטוכונדריאליים, כולל שינויים לאחר תרגום (PTM) של חלבונים מיטוכונדריאליים, ביוגנזה מיטוכונדריאלית, איחוי, ביקוע ומיטופגיה 9,10. ביקוע מיטוכונדריאלי בתיווך חלבון 1 הקשור לדינמין (DRP1), GTPase של משפחת-העל של הדינמין של חלבונים, יוצר מיטוכונדריה קטנה ועגולה ומבודד את המיטוכונדריה הלא מתפקדת, אשר ניתנת לניקוי ולפירוק על ידי מיטופגיה11,12.

מיטופגיה היא תהליך תאי המפרק באופן סלקטיבי את המיטוכונדריה על ידי אוטופגיה, המתרחשת בדרך כלל במיטוכונדריה פגומה בעקבות פציעה, הזדקנות או סטרס. לאחר מכן, מיטוכונדריה אלה מועברים לליזוזומים לצורך פירוק10. לפיכך, מיטופגיה היא תהליך קטבולי המסייע בשמירה על כמות ואיכות המיטוכונדריה במצב בריא במגוון רחב של סוגי תאים. הוא ממלא תפקיד מכריע בשיקום הומאוסטזיס תאי בתנאי פיזיולוגיה ועקה רגילים13,14. התאים מאופיינים במנגנון מיטופגיה מורכב, המושרה על ידי אותות שונים של לחץ תאי ושינויים התפתחותיים. מסלולי ויסות מיטופגיים מסווגים כתלויי יוביקוויטין או תלויי קולטן15,16; האוטופגיה התלויה באוביקוויטין מתווכת על ידי קינאז PINK1 וגיוס של אוביקוויטין ליגאז פרקין E3 למיטוכונדריה 17,18, בעוד שאוטופגיה תלוית קולטן כרוכה בקשירת קולטני אוטופגיה לשרשרת האור החלבונית הקשורה למיקרוטובול LC3 המתווכת מיטופגיה בתגובה לנזק למיטוכונדריה19.

מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) היא השיטה הנפוצה ביותר, ועדיין אחת השיטות הטובות ביותר, כדי לבחון ולזהות mitophagy20. המאפיינים המורפולוגיים של מיטופגיה הם אוטופגוזומים או אוטוליזוזומים הנוצרים על ידי היתוך של אוטופגוזומים עם ליזוזומים, אשר ניתן לצפות בהם מתמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים21. החולשה של מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM), לעומת זאת, היא חוסר היכולת לנטר את התהליכים הדינמיים של מיטופגיה, כגון דה-פולריזציה של המיטוכונדריה, ביקוע מיטוכונדריאלי ואיחוי של אוטופגוזומים וליזוזומים, בתא החי20. לפיכך, הערכת מיטופגיה באמצעות הדמיה של אברונים חיים היא שיטה חלופית אטרקטיבית למחקר מיטוכונדריאלי. טכניקת הדמיית התאים החיים המתוארת כאן משתמשת בשני צבעים פלואורסצנטיים כדי להכתים את המיטוכונדריה ואת הליזוזומים. כאשר מתרחשת מיטופגיה, מיטוכונדריה פגומה או מיותרת שנבלעת על ידי אוטופגוזומים מוכתמת בירוק על ידי הצבע המיטוכונדריאלי, בעוד שהצבע האדום מכתים את הליזוזומים. ההיתוך של אוטופגוזומים וליזוזומים אלה, המכונים אוטוליזוזומים, גורם לפלואורסצנציה הירוקה והאדומה לחפוף ולהתבטא כנקודות צהובות, ובכך מצביע על התרחשות של מיטופגיה22. צבע המיטוכונדריה בעל התכולה (MitoTracker Green) מכיל מואטי כלורומתיל בעל תגובת קלה של תיול כדי לסמן את המיטוכונדריה23. כדי לתייג את המיטוכונדריה, התאים פשוט דוגרים עם הצבע, אשר מתפזר באופן פסיבי על פני קרום הפלזמה ומצטבר במיטוכונדריה פעילה. צבע מיטוכונדריה זה יכול בקלות להכתים תאים חיים, והוא פחות יעיל בהכתמת תאים קבועים או מתים של אלדהיד. צבע ליזוזום (LysoTracker Red) הוא גשושית פלואורסצנטית חומצית המשמשת לתיוג ומעקב אחר אברונים חומציים בתאים חיים. צבע זה מפגין סלקטיביות גבוהה עבור אברונים חומציים ויכול לסמן ביעילות תאים חיים בריכוזים ננומולריים24.

ההליכים לשימוש בצבעים פלואורסצנטיים אלה בתאים חיים, כולל טעינת הצבעים והדמיה של מיטוכונדריה וליזוזומים, מוצגים כאן. שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים לצפות במיטופגיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים. ניתן להשתמש בו גם לכימות מיטוכונדריה וליזוזומים, ולהערכת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים ומעבר

הערה: הפרוטוקול מתואר באמצעות פיברובלסטים עובריים (MEFs) של עכברים בתרבית שגרתית כדוגמה.

  1. תרבית תאי MEF במנות תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו. דגירה ב-37°C ו-5% CO2 וניטור התאים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 100.
  2. בצע העברת תאים שגרתית.
    1. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%-90% (כל 3 ימים), שטפו את התאים עם 2 מ"ל של תמיסת מלח עם מאגר פוספטים (DPBS) של דולבקו. לאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA במשך דקה אחת כדי לנתק את התאים, ואחריו 2 מ"ל של DMEM כדי לעצור את הפעולה של טריפסין-EDTA. צנטריפוגה של מתלה התא ב 100 x g במשך 3 דקות להשעות את גלולת התא ב 1 מ"ל של DMEM.
    2. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי ושקופיות תא ספירת תאים (ראו טבלת חומרים), ולאחר מכן חסן 1.5 x 106 תאים לתוך צלחת תרבית תאים חדשה בגודל 10 ס"מ המכילה 10 מ"ל של DMEM.
  3. עבור הבדיקה mitophagy, להכין השעיה התא כמו בשלב 1.2.1. דלל את מתלה התא ל-1 x 105 תאים למ"ל ב-DMEM טרי.
  4. הוסיפו 2 מ"ל מתלי התאים המדוללים לצלחת קונפוקלית בקוטר 20 מ"מ (ראו טבלת חומרים) ונערו את צלחת התרבית ב"צלב". לדגום את צלחת תרבית התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 24 שעות.

2. כתמים במיטוכונדריה

  1. הסר את תמיסת המניות של הצבע המיטוכונדריאלי הירוק-פלואורסצנטי וצבע ליזוזום פלואורסצנטי אדום (ראו טבלת חומרים) מהמקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  2. הכן פתרונות עבודה של הצבעים על ידי דילול פתרונות המלאי 1:1,000 ב- DMEM וערבב היטב. לדוגמה, הוסף 2 μL כל אחד של 1 mM צבע מיטוכונדריאלי וצבע ליזוזום ל 2 מ"ל של DMEM כדי לקבל ריכוז עבודה של 1 μM עבור שני הצבעים.
  3. מוציאים את המדיום מצלחת התרבית הקונפוקלית (שלב 1.4). הוסף 1 מ"ל של תמיסת צביעה (מוכן בשלב 2.2) כדי לכסות את התאים. מניחים את צלחת תרבית התאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 20-30 דקות.

3. הדמיה קונפוקלית

  1. הכינו 1 ליטר של חיץ קרבס-הנסלייט (KH) (138.2 mM NaCl, 3.7 mM KCl, 0.25 mM CaCl 2, 1.2 mM KH 2 PO 4, 1.2 mM MgSO 4.7H2O, 15 mM גלוקוז ו-21.85 mM HEPES; pH סופי 7.4) ואחסנוב-4 °C (עד חודש אחד).
  2. ביום ההדמיה הקונפוקלית, מוציאים מראש את חיץ ה-KH מהמקרר ומחממים אותו מראש לטמפרטורת החדר (20 עד 25 מעלות צלזיוס).
  3. הגדר את הפרמטרים של תוכנת ההדמיה של מיקרוסקופיה קונפוקלית (ראה טבלת חומרים): עבור תמונות עירור כפולות, השתמש בעירור רציף ב- 488 ננומטר ו- 543 ננומטר, ואסוף פליטה ב- 505-545 ננומטר ו- >560 ננומטר, בהתאמה.
    הערה: הגדר את הגדרות ההדמיה באופן הבא. מצב סריקה: מסגרת; מהירות: 9; ממוצע: מספר, 1; רווח: 450 עד 600; חור סיכה: 30 עד 200; לייזר: <10%. עדיף להפעיל את תוכנת ההדמיה תחילה ולאחר מכן להפעיל לחלוטין את לייזר 488 ננומטר. יש להפעיל ולייצב את הלייזר בקוטר 543 ננומטר למשך 3-5 דקות לפני השימוש (איור 1A).
  4. הסר את מדיום התרבית המכיל את הצבע מהאינקובטור (שלב 2.3) והוסף 1 מ"ל של חיץ KH לצלחת.
  5. כדי לגרום למיטופגיה, טפלו בתאים עם קרבוניל ציאניד-4-(טריפלואורומתוקסי) פנילהידרזון (FCCP) ב-1 מיקרומטר (ריכוז סופי) במאגר KH למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ומיד המשיכו לדמות את התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
  6. יש למרוח כמות מתאימה של שמן על החלק העליון של עדשת השמן 63x (ראו טבלת חומרים). הניחו את דגימת התא על שלב הדגימה של המיקרוסקופ הקונפוקלי והזיזו אותה ישירות מעל העדשה האובייקטיבית.
  7. השתמש בתוכנת ההדמיה כדי למצוא את הדוגמה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה איתור בפינה השמאלית העליונה של ממשק התוכנה (איור 1B). בחרו ערכת מסננים ירוקה לניסוי.
  8. השתמש בידית הכוונון הגסה כדי להתמקד במהירות על-ידי הזזת העדשה האובייקטיבית למעלה ולמטה. לאחר שדגימת התא נראית בבירור דרך העינית, חפש ומקד את האזור של תאים בודדים והזז אותו למרכז שדה הראייה.
  9. לחץ על רכישה הכרטיסייה בפינה השמאלית העליונה בממשק התוכנה כדי לקבל תמונות. בחר רק את ערוץ 488 ננומטר ואת רזולוציית המסגרת 1024 x 1024 לתצוגה מקדימה.
  10. לחץ על הכרטיסייה Live בפינה הימנית העליונה כדי להתחיל סריקה בשידור חי. כוונן את שדה הראייה לחד ביותר וכוונן את עוצמת הלייזר על-ידי הזזת המחוון שמאלה או ימינה (איור 1A). שמור על הגדרת הרווח מתחת ל-600 כדי למנוע חשיפת יתר.
  11. התאם את ערך חור הסיכה ל- 156, ערך ההקזת הערך ל- 545 וערך ההסטה הדיגיטלית ל- 0.
  12. בחר את שדה הראייה הטוב ביותר, בדוק את שני הערוצים (488 ננומטר ו- 543 ננומטר) ובחר ברזולוציית המסגרת 1024 x 1024. לחץ על הצמד כדי לקבל תמונות דו-ממדיות. שמור את התמונות שנרכשו.
    הערה: לצבע המיטוכונדריה הירוק יש שיא עירור ב-490 ננומטר ושיא פליטה ב-516 ננומטר; זה יכול להיות נרגש באמצעות לייזר 488 ננומטר. לצבע הליזוזום האדום יש שיא עירור ב-576 ננומטר ושיא פליטה ב-590 ננומטר; זה יכול להיות נרגש באמצעות לייזר 543 ננומטר.

4. ניתוח תמונות

  1. פתח את התמונה שנשמרה באמצעות ImageJ וייבא לתוכה את התמונה הממוזגת.
  2. ספרו ידנית את מספר הנקודות הצהובות בכל תא, המציינות כי הליזוזום בולע את המיטוכונדריה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MitoTracker Green הוא כתם מיטוכונדריאלי ירוק-פלואורסצנטי המסוגל למקם במדויק את המיטוכונדריה. הצבע יכול בקלות להכתים תאים חיים והוא פחות יעיל בהכתמת תאים קבועים או מתים של אלדהיד (איור 2). צבע הליזוזום האדום-פלואורסצנטי LysoTracker Red מסוגל לסמן ולעקוב אחר אברונים ליזוזומליים חומציים ויכול רק להכתים תאים חיים (איור 2). הדמיית מיקרוסקופ קונפוקלי מאפשרת הדמיה של מיטוכונדריה וליזוזומים המוכתמים בצבעים המתאימים (איור 1 ואיור 2).

מיטופגיה היא תהליך תאי קטבולי המפרק באופן סלקטיבי את המיטוכונדריה על ידי אוטופגיה, המתרחשת בדרך כלל במיטוכונדריה פגומה לאחר פציעה, הזדקנות או מתח20. לאחר מכן, מיטוכונדריות אלה מועברות לליזוזומים לצורך פירוק. מיטופגיה מסייעת בשמירה על כמות ואיכות המיטוכונדריה במצב בריא במגוון רחב של סוגי תאים. בתאי יונקים בריאים, mitophagy מתרחשת לעתים רחוקות, ולכן גירויים אחרים נדרשים כדי לגרום לתהליך זה25. קרבוניל ציאניד-4 (טריפלואורומתוקסי) פנילהידרזון (FCCP), תת-הפרדה מיטוכונדריאלית, הוא יונופור לא ספציפי הגורם לאובדן חמור של פוטנציאל קרום המיטוכונדריה תוך דקות, שינוי ב-pH תוך-תאי, ובעקבות זאתמיטופגיה 26,27. במחקר זה, FCCP שימש להפעלת מיטופגיה בתאי MEF לצורך הדמיה קונפוקלית. כאשר מיטוכונדריה פגועה המוכתמת בירוק נבלעת על-ידי ליזוזומים המוכתמים באדום, הפלואורסצנטיות הירוקה והאדומה חופפות וחושפות מיטוכונדריה-ליזוזומים צהובים מקומיים (איור 3). הנקודות הצהובות באיור 3D ובאיור 4B תואמות את המיטוכונדריה-ליזוזומים המקומיים האלה, המייצגים מיטופגיה מתמשכת, ולכן ניתן לספור אותן כדי להעריך את היקף המיטופגיה (איור 4).

Figure 1
איור 1: פרמטרי הדמיה של תוכנת ההדמיה של מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: המחשה סכמטית של הדמיה קונפוקלית של תאים חיים. התאים החיים מוכתמים יחד עם הצבע המיטוכונדריאלי הירוק-פלואורסצנטי והצבע הליזוזומלי האדום-פלואורסצנטי, ואז התאים החיים מצולמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. עיבוד תמונה וניתוח נתונים בוצע באמצעות תוכנת ההדמיה הקשורה למיקרוסקופ או תמונה J. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הדמיה קונפוקלית של תאים חיים. (A) תמונות מייצגות של תאים המוכתמים בצבע המיטוכונדריה הירוק-פלואורסצנטי מראות את המיטוכונדריה. (B) תמונות מייצגות של תאים המוכתמים בצבע ליזוזום אדום-פלואורסצנטי המציג את הליזוזום. (C) תמונה ממוזגת של שני הצבעים הפלואורסצנטיים. (D) שטח מורחב המציג מיטופגיה. החץ הלבן מציין מיטוכונדריה ירוקה הנבלעת בליזוזומים אדומים. קיצור: Ex = אורך גל עירור. צבע המיטוכונדריה הירוק-פלואורסצנטי נרגש ב-488 ננומטר עם פליטה שנאספת ב-505-545 ננומטר. צבע הליזוזום האדום-פלואורסצנטי מתרגש ב-543 ננומטר עם פליטה שנאספת ב->560 ננומטר. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: מיטופגיה המופעלת על-ידי גירוי FCCP . (A) תמונות מייצגות של תאים המוכתמים יחד עם צבע המיטוכונדריה הירוק-פלואורסצנטי וצבע הליזוזום האדום-פלואורסצנטי. (B) תמונות מייצגות של תאים שטופלו ב-FCCP של 1 μM במשך 10 דקות. החץ הלבן מציין מיטוכונדריה ירוקה הנבלעת בליזוזומים אדומים. (C) נתונים כמותיים של מיטופגיה שצוינו על ידי שכבת-על ליזוזומלית-מיטוכונדרית. הנתונים ממוצעים ± SEM, n = 8 תאים. *p < 0.05 לעומת שליטה. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה להערכה ולניטור התהליך הדינמי של מיטופגיה בתאים חיים, הכולל אוטופגוזומים, ליזוזומים וביקוע מיטוכונדריאלי, באמצעות צביעה משותפת עם מיטוכונדריה וצבעי ליזוזום המיועדים לתאים. השיטה יכולה לשמש גם לזיהוי מיטוכונדריה ולהערכת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית. שני הצבעים ששימשו במחקר זה צריכים להיות מוגנים מפני אור, יש להימנע ממחזורי הפשרה מרובים בהקפאה, ויש לאחסן את הצבעים באליקות חד-פעמיות ככל האפשר. מומלץ להכין תמיסות עבודה של הצבעים כדי להימנע מהוספתם ישירות למדיום תרבית התאים, מה שעלול לגרום לריכוזים מקומיים גבוהים ולערבוב לא מספק של הצבעים. כדי למנוע הכתמה של מבנים תאיים אחרים, יש להכתים את תאי ה-MEF במשך 30 דקות לפני ההדמיה במיקרוסקופ הקונפוקלי. מומלץ לבצע את הליך ההכתמה מיד לפני ההדמיה. בתאי MEF, גם צבעי המיטוכונדריה וגם צבעי הליזוזום ב-1 μM ממוקמים היטב במיטוכונדריה ובליזוזומים, בהתאמה, עם ריכוזי צבע גבוהים יותר וכתוצאה מכך ציטוטוקסיות כמו גם צביעה לא ספציפית של מבנים תאיים אחרים. ריכוז זה אופטימלי גם להכתמת מיטוכונדריה וליזוזומים בתאי H9C2. עבור קווי תאים אחרים, ריכוז הצבע וזמן ההכתמה המאפשרים לצבע להתמקם היטב באברונים צריכים להיות אופטימליים. כדי לקבל תמונות ברורות של מיטוכונדריה וליזוזומים, יש להתאים את הפרמטרים של איסוף התמונות (ראו הערה בשלב 3.3) באופן מצפוני. מפגש תאים בשיעור של 50%-60% הוא חיוני לקבלת תמונות בודדות של תאים חיים, ולכן יש לספור את התאים לפני הזריעה. אם במעבדה אין כלים קונפוקליים, ניתן להשתמש בכיסויים עגולים כחלופה. בחלק מהמחקרים בבעלי חיים, במיוחד בבדיקות קליניות, קשה לזהות מיטופגיה בדגימות רקמה חיה בבעלי חיים בשל היעדר ניסויים כמותיים אמינים ונוחים לחקר מיטופגיה. אף על פי כן, ניתן להעריך מיטופגיה בתאים שבודדו מרקמות בעלי חיים באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן. מגבלה של שיטה זו היא שלמרות ששני הצבעים יכולים בקלות להכתים תאים חיים, הם פחות יעילים בהכתמת תאים מתים או קבועים באלדהיד.

בנוסף לצבעים ששימשו במחקר זה, עוקבים אחרים אחר מיטוכונדריה וליזוזום, כגון MitoMM1/2 ו- LysoKK, בהתאמה, זמינים כיום לחוקרים להערכת mitophagy28,29. בעוד ש-MitoMM1/2 יכול להכתים את המיטוכונדריה בתאים או רקמות קבועים בפרפורמלדהיד, הוא אינו יכול להעריך ישירות את המיטופגיה ודורש צביעה כפולה עם נוגדן ספציפי, כגון anti-LC3B, כדי לזהות מיטופגיה. מאחר ש-LysoKK יכול להכתים רק תאים חיים, השילוב של צבעים אלה יכול גם לזהות אוטופגיה מיטוכונדריאלית רק בתאים חיים28,29. עם זאת, MitoMM1/2 קל לשימוש ומאפשר שימוש במסנן TRITC (מכיוון שהוא אינו מראה עירור בעת שימוש בלייזר כחול ואינו מייצר פליטה ירוקה). LysoKK יכול להכתים אברונים תוך 5 דקות, מה שמקל על ניטור והערכה מהירים של גירויים רבים28,29.

מיטופגיה מתרחשת בתאים באמצעות מנגנון מורכב, אשר מושרה על ידי אותות עקה תאיים שונים ושינויים התפתחותיים. FCCP, תוסף רב-עוצמה של זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי, הוא יונופור26 לא ספציפי ששימש להשראת מיטופגיה במחקר זה. FCCP (1 μM) מפריע לשיפוע הפרוטון על ידי הובלת פרוטונים על פני קרום המיטוכונדריה הפנימי, תהליך שגורם לשינוי ב- pH התוך-תאי. לפיכך, FCCP יכול לגרום לאובדן חמור של פוטנציאל קרום המיטוכונדריה תוך דקות ולאחר מכן לגרום לאוטופגיה מיטוכונדריאלית על ידי גיוס פרקין ושרשרת אור חלבון הקשורה למיקרוטובול 3 (LC3) למיטוכונדריה26,27,30. מסלולים רגולטוריים של מיטופגיה מסווגים כתלויי יוביקוויטין (PINK1-בתיווך פרקין) או תלויי קולטן (בתיווך LC3 וקולטנים אחרים)15,16. מיטופגיה נחקרה באמצעות נוגדנים ספציפיים הנקשרים למולקולות מפתח במסלול האוטופגי התלוי בקולטן, כגון LC3B, ולאחר מכן מכתים יחד עם צבע ליזוזום פלואורסצנטי אדום31,32. למרות שקשה להבדיל בין שני מסלולים אלה באמצעות הצבעים המשמשים בפרוטוקול זה, הם מציעים שיטה פשוטה להעריך את מידת המיטופגיה בתאים חיים ולהעריך מורפולוגיה מיטוכונדריאלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81970333,31901044,), והתוכנית לפרופסור למינוי מיוחד במוסדות להשכלה גבוהה בשנחאי (GZ2020008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated cell counter Countstar IC1000
Cell counting chamber slides Countstar 12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Corning 10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Corning 21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish) NEST 801002
Image J (Rasband, NIH) NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer Self-prepared
LysoTracker Red Invitrogen 1818430 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green Invitrogen 1842298 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts Self-prepared
Objective (63x oil lens) ZEISS ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25% Gibico Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope ZEISS ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) ZEISS ZEN 2.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
  2. Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
  3. Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
  5. Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
  6. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  7. Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
  8. Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
  9. Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
  10. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
  11. Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
  12. Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
  13. Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
  14. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
  15. Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
  16. Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
  17. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  18. Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
  19. Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
  20. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
  21. Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
  22. Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
  23. Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
  24. Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
  25. Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  26. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  27. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  28. Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
  29. Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
  30. Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
  31. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  32. Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).

Tags

ביולוגיה גיליון 189
הדמיה של מיטופגיה עם צבעים פלואורסצנטיים למיטוכונדריה וליזוזום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L.,… More

Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L., Gao, M., Gong, G. Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome. J. Vis. Exp. (189), e64647, doi:10.3791/64647 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter