Summary
La mitofagia è il meccanismo primario del controllo di qualità mitocondriale. Tuttavia, la valutazione della mitofagia in vivo è ostacolata dalla mancanza di saggi quantitativi affidabili. Presentato qui è un protocollo per l'osservazione della mitofagia nelle cellule viventi utilizzando un colorante mitocondriale fluorescente verde e un colorante lisosoma rosso-fluorescente.
Abstract
I mitocondri, essendo le centrali elettriche della cellula, svolgono ruoli importanti nella bioenergetica, nella generazione di radicali liberi, nell'omeostasi del calcio e nell'apoptosi. La mitofagia è il meccanismo primario del controllo della qualità mitocondriale ed è generalmente studiata utilizzando l'osservazione microscopica, tuttavia i saggi di mitofagia in vivo sono difficili da eseguire. La valutazione della mitofagia mediante imaging di organelli vivi è un metodo alternativo e necessario per la ricerca mitocondriale. Questo protocollo descrive le procedure per l'utilizzo del colorante mitocondriale fluorescente verde MitoTracker Green e del colorante lisosoma rosso-fluorescente LysoTracker Red nelle cellule vive, compreso il caricamento dei coloranti, la visualizzazione dei mitocondri e del lisosoma e i risultati attesi. Vengono inoltre forniti passaggi dettagliati per la valutazione della mitofagia in cellule vive, nonché note tecniche sulle impostazioni del software del microscopio. Questo metodo può aiutare i ricercatori a osservare la mitofagia usando la microscopia fluorescente a cellule vive. Inoltre, può essere utilizzato per quantificare mitocondri e lisosomi e valutare la morfologia mitocondriale.
Introduction
I mitocondri sono le centrali elettriche di quasi tutte le cellule eucariotiche 1,2. Oltre alla produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa, i mitocondri svolgono un ruolo vitale in altri processi come la bioenergetica, l'omeostasi del calcio, la generazione di radicali liberi, l'apoptosi e l'omeostasi cellulare 3,4,5. Poiché i mitocondri generano specie reattive dell'ossigeno (ROS) da più complessi nella catena di trasporto degli elettroni, sono costantemente stimolati da potenziale stress ossidativo, che può eventualmente portare a danni strutturali e disfunzioni quando il sistema di difesa antiossidante collassa 6,7. È stato scoperto che la disfunzione mitocondriale contribuisce a molte malattie, tra cui disturbi metabolici, neurodegenerazione e malattie cardiovascolari8. Pertanto, è fondamentale mantenere sane le popolazioni mitocondriali e la loro corretta funzione. I mitocondri sono organelli altamente plastici e dinamici; la loro morfologia e funzione sono controllate da meccanismi di controllo della qualità mitocondriale, comprese le modificazioni post-traduzionali (PTM) delle proteine mitocondriali, la biogenesi mitocondriale, la fusione, la fissione e la mitofagia 9,10. La fissione mitocondriale mediata dalla proteina 1 correlata alla dinamina (DRP1), una GTPasi della superfamiglia di proteine della dinamina, provoca mitocondri piccoli e rotondi e isola i mitocondri disfunzionali, che possono essere eliminati e degradati dalla mitofagia11,12.
La mitofagia è un processo cellulare che degrada selettivamente i mitocondri per autofagia, di solito si verifica nei mitocondri danneggiati a seguito di lesioni, invecchiamento o stress. Successivamente, questi mitocondri vengono consegnati ai lisosomi per la degradazione10. Pertanto, la mitofagia è un processo catabolico che aiuta a mantenere la quantità e la qualità dei mitocondri in uno stato sano in una vasta gamma di tipi di cellule. Svolge un ruolo cruciale nel ripristino dell'omeostasi cellulare in normali condizioni fisiologiche e di stress13,14. Le cellule sono caratterizzate da un complesso meccanismo mitofagia, che è indotto da diversi segnali di stress cellulare e cambiamenti dello sviluppo. Le vie regolatorie della mitofagia sono classificate come ubiquitina-dipendenti o recettore-dipendenti15,16; l'autofagia ubiquitina-dipendente è mediata dalla chinasi PINK1 e dal reclutamento dell'ubiquitina ligasi Parkin E3 nei mitocondri 17,18, mentre l'autofagia recettore-dipendente comporta il legame dei recettori dell'autofagia alla catena leggera LC3 della proteina associata ai microtubuli che media la mitofagia in risposta al danno mitocondriale19.
La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è il metodo più comunemente usato, e ancora uno dei metodi migliori, per osservare e rilevare la mitofagia20. Le caratteristiche morfologiche della mitofagia sono autofagosomi o autolisosomi formati dalla fusione di autofagosomi con lisosomi, che possono essere osservati da immagini al microscopio elettronico21. La debolezza della microscopia elettronica (EM), tuttavia, è l'incapacità di monitorare i processi dinamici della mitofagia, come la depolarizzazione mitocondriale, la fissione mitocondriale e la fusione di autofagosomi e lisosomi, nella cellula vivente20. Pertanto, la valutazione della mitofagia attraverso l'imaging degli organelli viventi è un metodo alternativo interessante per la ricerca mitocondriale. La tecnica di imaging delle cellule vive qui descritta utilizza due coloranti fluorescenti per colorare mitocondri e lisosomi. Quando si verifica la mitofagia, i mitocondri danneggiati o superflui inghiottiti dagli autofagosomi sono macchiati di verde dal colorante mitocondriale, mentre il colorante rosso colora i lisosomi. La fusione di questi autofagosomi e lisosomi, indicati come autolisosomi, fa sì che la fluorescenza verde e rossa si sovrapponga e si manifesti come punti gialli, indicando così la presenza di mitofagia22. Il colorante mitocondriale permeato dalle cellule (MitoTracker Green) contiene una porzione di clorometil leggermente tiolo-reattiva per etichettare i mitocondri23. Per marcare i mitocondri, le cellule vengono semplicemente incubate con il colorante, che si diffonde passivamente attraverso la membrana plasmatica e si accumula nei mitocondri attivi. Questo colorante mitocondriale può facilmente macchiare le cellule vive ed è meno efficace nella colorazione delle cellule morte o fissate con aldeidi. Il colorante lisosoma (LysoTracker Red) è una sonda acidotropica fluorescente utilizzata per l'etichettatura e il monitoraggio degli organelli acidi nelle cellule vive. Questo colorante presenta un'elevata selettività per gli organelli acidi e può marcare efficacemente le cellule vive a concentrazioni nanomolari24.
Le procedure per l'utilizzo di questi coloranti fluorescenti nelle cellule viventi, compreso il caricamento dei coloranti e la visualizzazione di mitocondri e lisosomi, sono presentate qui. Questo metodo può aiutare i ricercatori a osservare la mitofagia usando la microscopia fluorescente a cellule vive. Può anche essere usato per quantificare mitocondri e lisosomi e valutare la morfologia mitocondriale.
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Protocol
1. Coltura cellulare e passaggio
NOTA: Il protocollo è descritto utilizzando fibroblasti embrionali di topo (MEF) coltivati di routine come esempio.
- Colture di cellule MEF in piastre di coltura cellulare da 10 cm con 10 ml di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco. Incubare a 37 °C e 5% di CO2 e monitorare le cellule al microscopio con un ingrandimento di 100x.
- Eseguire il passaggio cellulare di routine.
- Quando le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza (ogni 3 giorni), lavare le cellule con 2 ml di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS). Quindi aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA allo 0,05% per 1 minuto per dissociare le cellule, seguito da 2 ml di DMEM per fermare l'azione della tripsina-EDTA. Centrifugare la sospensione cellulare a 100 x g per 3 minuti e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di DMEM.
- Contare le cellule utilizzando un contatore automatico delle cellule e vetrini della camera di conteggio delle cellule (vedere Tabella dei materiali), quindi inoculare 1,5 x 106 cellule in un nuovo piatto di coltura cellulare da 10 cm contenente 10 ml di DMEM.
- Per il saggio della mitofagia, preparare una sospensione cellulare come al punto 1.2.1. Diluire la sospensione cellulare a 1 x 105 cellule/ml in DMEM fresco.
- Aggiungere 2 mL della sospensione cellulare diluita in un piatto confocale da 20 mm (vedere Tabella dei materiali) e agitare il piatto di coltura in una "croce". Incubare il piatto di coltura cellulare in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
2. Colorazione mitocondriale
- Rimuovere le aliquote della soluzione madre del colorante mitocondriale fluorescente verde e del colorante lisosoma fluorescente rosso (vedere tabella dei materiali) dal congelatore a -20 °C.
- Preparare le soluzioni di lavoro dei coloranti diluendo le soluzioni stock 1:1.000 in DMEM e mescolare bene. Ad esempio, aggiungere 2 μL ciascuno di 1 mM di colorante mitocondriale e colorante lisosoma a 2 ml di DMEM per ottenere una concentrazione di lavoro di 1 μM per entrambi i coloranti.
- Rimuovere il terreno dal piatto di coltura confocale (punto 1.4). Aggiungere 1 mL della soluzione colorante (preparata al punto 2.2) per coprire le cellule. Porre il piatto di coltura cellulare in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO2 per 20-30 min.
3. Imaging confocale
- Preparare 1 L di tampone Krebs-Henseleit (KH) (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl 2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4,7H2O, 15 mM glucosio e 21,85 mM HEPES;pH finale 7,4) e conservare a4 °C (fino a 1 mese).
- Il giorno dell'imaging confocale, rimuovere preventivamente il tampone KH dal frigorifero e preriscaldarlo a temperatura ambiente (da 20 a 25 °C).
- Impostare i parametri del software di imaging per microscopia confocale (vedere Tabella dei materiali): per le immagini a doppia eccitazione, utilizzare l'eccitazione sequenziale a 488 nm e 543 nm e raccogliere l'emissione rispettivamente a 505-545 nm e >560 nm.
NOTA: impostare le impostazioni di imaging come segue. Modalità di scansione: fotogramma; Velocità: 9; Media: numero, 1; Guadagno: da 450 a 600; Foro stenopeico: da 30 a 200; Laser: <10%. È meglio avviare prima il software di imaging e quindi accendere completamente il laser a 488 nm. Il laser a 543 nm deve essere acceso e stabilizzato per 3-5 minuti prima dell'uso (Figura 1A). - Rimuovere il terreno di coltura contenente il colorante dall'incubatore (punto 2.3) e aggiungere 1 mL di tampone KH al piatto.
- Per indurre la mitofagia, trattare le cellule con carbonil-cianuro-4-(trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP) a 1 μM (concentrazione finale) in tampone KH per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere immediatamente all'immagine delle cellule utilizzando il microscopio confocale.
- Applicare una quantità appropriata di olio sulla parte superiore della lente dell'olio 63x (vedere Tabella dei materiali). Posizionare il campione cellulare sullo stadio del campione del microscopio confocale e spostarlo direttamente sopra la lente dell'obiettivo.
- Utilizzare il software di imaging per trovare l'esempio facendo clic sulla scheda Trova nell'angolo superiore sinistro dell'interfaccia software (Figura 1B). Seleziona un set di filtri verde per l'esperimento.
- Utilizzare la manopola di regolazione grossolana per mettere a fuoco rapidamente spostando l'obiettivo verso l'alto e verso il basso. Dopo che il campione di cellule è chiaramente visibile attraverso l'oculare, cercare e focalizzare l'area delle singole cellule e spostarla al centro del campo visivo.
- Fare clic sulla scheda Acquisizione nell'angolo in alto a sinistra nell'interfaccia del software per acquisire immagini. Selezionare solo il canale a 488 nm e la risoluzione del fotogramma 1024 x 1024 per l'anteprima.
- Fare clic sulla scheda Live nell'angolo in alto a sinistra per avviare una scansione dal vivo. Regolare il campo visivo al massimo e regolare la potenza del laser spostando il cursore a sinistra o a destra (Figura 1A). Mantenere l'impostazione del guadagno al di sotto di 600 per evitare la sovraesposizione.
- Regolate il valore stenopeico su 156, il valore di guadagno su 545 e il valore di offset digitale su 0.
- Seleziona il miglior campo visivo, controlla i due canali (488 nm e 543 nm) e scegli la risoluzione del fotogramma 1024 x 1024. Fare clic su Snap per acquisire immagini 2D. Salvare le immagini acquisite.
NOTA: Il colorante mitocondriale verde ha un picco di eccitazione a 490 nm e un picco di emissione a 516 nm; Può essere eccitato usando un laser a 488 nm. Il colorante lisosoma rosso ha un picco di eccitazione a 576 nm e un picco di emissione a 590 nm; Può essere eccitato utilizzando un laser a 543 nm.
4. Analisi delle immagini
- Aprire l'immagine salvata con ImageJ e importarvi l'immagine unita.
- Contare manualmente il numero di punti gialli in ogni cellula, che indicano che il lisosoma sta inghiottendo i mitocondri.
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Representative Results
MitoTracker Green è una colorazione mitocondriale verde-fluorescente che è in grado di localizzarsi con precisione nei mitocondri. Il colorante può facilmente macchiare le cellule vive ed è meno efficace nella colorazione delle cellule fissate o morte con aldeide (Figura 2). Il colorante lisosoma rosso-fluorescente LysoTracker Red è in grado di marcare e tracciare organelli lisosomiali acidi e può solo macchiare cellule vive (Figura 2). L'imaging al microscopio confocale consente la visualizzazione di mitocondri e lisosomi colorati con i coloranti appropriati (Figura 1 e Figura 2).
La mitofagia è un processo cellulare catabolico che degrada selettivamente i mitocondri per autofagia, che di solito si verifica nei mitocondri danneggiati dopo lesioni, invecchiamento o stress20. Successivamente, questi mitocondri vengono consegnati ai lisosomi per la degradazione. La mitofagia aiuta a mantenere la quantità e la qualità dei mitocondri in uno stato sano in una vasta gamma di tipi di cellule. Nelle cellule sane dei mammiferi, la mitofagia si verifica raramente, e quindi sono necessari altri stimoli per indurre questo processo25. Il cianuro-4 carbonile (trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP), un disaccoppiatore mitocondriale, è uno ionoforo aspecifico che causa una grave perdita di potenziale di membrana mitocondriale in pochi minuti, alterazione del pH intracellulare e successiva mitofagia26,27. In questo studio, FCCP è stato utilizzato per innescare la mitofagia nelle cellule MEF per l'imaging confocale. Quando i mitocondri colorati di verde danneggiati vengono inghiottiti da lisosomi colorati di rosso, la fluorescenza verde e rossa si sovrappongono per rivelare mitocondri-lisosomi co-localizzati gialli (Figura 3). I punti gialli in Figura 3D e Figura 4B corrispondono a questi mitocondri-lisosomi co-localizzati, che rappresentano la mitofagia in corso, e quindi possono essere contati per valutare l'estensione della mitofagia (Figura 4).
Figura 1: Parametri di imaging del software di imaging per microscopia confocale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Illustrazione schematica dell'imaging confocale di cellule vive. Le cellule vive sono co-colorate con il colorante mitocondriale verde-fluorescente e il colorante lisosomiale rosso-fluorescente, quindi le cellule vive vengono visualizzate utilizzando la microscopia confocale. L'elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati sono state eseguite utilizzando il software di imaging associato al microscopio o l'immagine J. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging confocale di cellule vive. (A) Immagini rappresentative di cellule colorate con il colorante mitocondriale verde-fluorescente mostrano i mitocondri. (B) Immagini rappresentative di cellule colorate con il colorante lisosoma rosso-fluorescente che mostra il lisosoma. (C) Immagine unita di entrambi i coloranti fluorescenti. (D) Area espansa che mostra la mitofagia. La freccia bianca indica mitocondri verdi inghiottiti da lisosomi rossi. Abbreviazione: Ex = lunghezza d'onda dell'eccitazione. Il colorante mitocondriale verde-fluorescente è eccitato a 488 nm con emissione raccolta a 505-545 nm. Il colorante lisosoma rosso-fluorescente è eccitato a 543 nm con emissione raccolta a >560 nm. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Mitofagia innescata dalla stimolazione FCCP . (A) Immagini rappresentative di cellule co-colorate con il colorante mitocondriale verde-fluorescente e il colorante lisosoma rosso-fluorescente. (B) Immagini rappresentative di cellule trattate con FCCP da 1 μM per 10 minuti. La freccia bianca indica mitocondri verdi inghiottiti da lisosomi rossi. (C) Dati quantitativi di mitofagia indicati dall'overlay lisosomiale-mitocondriale. I dati sono medi ± SEM, n = 8 celle. *p < 0,05 rispetto al controllo. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per valutare e monitorare il processo dinamico della mitofagia nelle cellule viventi, che coinvolge autofagosomi, lisosomi e fissione mitocondriale, attraverso la co-colorazione con mitocondri e coloranti lisosomi. Il metodo può anche essere utilizzato per identificare i mitocondri e valutare la morfologia mitocondriale. Entrambi i coloranti utilizzati in questo studio dovrebbero essere protetti dalla luce, dovrebbero essere evitati cicli multipli di gelo-scongelamento e i coloranti dovrebbero essere conservati il più possibile in aliquote monouso. Si raccomanda di preparare soluzioni di lavoro dei coloranti per evitare di aggiungerli direttamente al terreno di coltura cellulare, che può comportare alte concentrazioni locali e una miscelazione inadeguata dei coloranti. Per evitare di colorare altre strutture cellulari, le cellule MEF devono essere colorate per 30 minuti prima dell'imaging con il microscopio confocale. Si consiglia di eseguire la procedura di colorazione immediatamente prima dell'imaging. Nelle cellule MEF, sia i mitocondri che i coloranti lisosomi a 1 μM sono ben localizzati rispettivamente nei mitocondri e nei lisosomi, con concentrazioni di coloranti più elevate con conseguente citotossicità e colorazione non specifica di altre strutture cellulari. Questa concentrazione è anche ottimale per colorare mitocondri e lisosomi nelle cellule H9C2. Per altre linee cellulari, la concentrazione del colorante e il tempo di colorazione che consentono al colorante di localizzarsi bene negli organelli devono essere ottimizzati. Per ottenere immagini chiare dei mitocondri e dei lisosomi, i parametri di raccolta delle immagini (vedere la nota al punto 3.3) devono essere regolati coscienziosamente. La confluenza cellulare al 50%-60% è fondamentale per ottenere singole immagini di cellule vive, e quindi le cellule devono essere contate prima della semina. Se il laboratorio non dispone di piatti confocali, è possibile utilizzare come alternativa i coprivetrini circolari. In alcuni studi sugli animali, specialmente negli esami clinici, è difficile rilevare la mitofagia nei campioni di tessuto vivente animale a causa della mancanza di esperimenti quantitativi affidabili e convenienti per studiare la mitofagia. Tuttavia, la mitofagia in cellule isolate da tessuti animali può essere valutata utilizzando il protocollo qui descritto. Una limitazione di questo metodo è che, sebbene entrambi i coloranti possano facilmente macchiare le cellule vive, sono meno efficaci nel colorare le cellule morte o fissate con aldeidi.
Oltre ai coloranti utilizzati in questo studio, altri traccianti di mitocondri e lisosomi, come MitoMM1/2 e LysoKK, rispettivamente, sono attualmente disponibili per i ricercatori per valutare la mitofagia28,29. Mentre MitoMM1/2 può colorare i mitocondri in cellule o tessuti fissati con paraformaldeide, non può valutare direttamente la mitofagia e richiede una doppia colorazione con un anticorpo specifico, come l'anti-LC3B, per rilevare la mitofagia. Poiché LysoKK può solo colorare cellule vive, la combinazione di questi coloranti può anche rilevare solo l'autofagia mitocondriale nelle cellule vive28,29. Tuttavia, MitoMM1/2 è facile da usare e consente l'uso del filtro TRITC (in quanto non mostra eccitazione quando si utilizza un laser blu e non produce emissione verde). LysoKK può colorare gli organelli entro 5 minuti, facilitando il rapido monitoraggio e la valutazione di numerosi stimoli28,29.
La mitofagia si verifica nelle cellule attraverso un meccanismo complesso, che è indotto da diversi segnali di stress cellulare e cambiamenti dello sviluppo. FCCP, un potente disaccoppiatore della fosforilazione ossidativa mitocondriale, è uno ionoforo26 non specifico che è stato utilizzato per indurre la mitofagia in questo studio. FCCP (1 μM) interferisce con il gradiente protonico trasportando protoni attraverso la membrana mitocondriale interna, un processo che provoca un cambiamento nel pH intracellulare. Pertanto, FCCP può causare una grave perdita di potenziale di membrana mitocondriale in pochi minuti e quindi indurre l'autofagia mitocondriale reclutando Parkin e la catena leggera della proteina associata ai microtubuli 3 (LC3) nei mitocondri26,27,30. Le vie regolatorie della mitofagia sono classificate come ubiquitina-dipendenti (PINK1-parkin-mediata) o recettore-dipendenti (mediate da LC3 e altri recettori)15,16. La mitofagia è stata studiata utilizzando anticorpi specifici che si legano a molecole chiave nella via autofagica recettore-dipendente, come LC3B, seguita da co-colorazione con colorante lisosoma fluorescente rosso31,32. Sebbene sia difficile distinguere tra questi due percorsi utilizzando i coloranti impiegati in questo protocollo, offrono un metodo semplice per valutare l'estensione della mitofagia nelle cellule viventi e valutare la morfologia mitocondriale.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), dalla National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) e dal Program for Professor of Special Appointment presso le Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
References
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