Summary
El presente protocolo combina la estimulación ex vivo y la citometría de flujo para analizar los perfiles de células T polifuncionales (T PF) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en niños vacunados contra el virus de la encefalitis japonesa (JEV). El método de detección y el esquema de color de citometría de flujo de los TPF específicos de JEV se probaron para proporcionar una referencia para estudios similares.
Abstract
La inmunidad mediada por células T juega un papel importante en el control de la infección por flavivirus, ya sea después de la vacunación o después de una infección natural. La "calidad" de una célula T debe evaluarse por función, y una mayor función se asocia con una protección inmune más potente. Las células T que pueden producir simultáneamente dos o más citoquinas o quimiocinas a nivel de una sola célula se denominan células T polifuncionales (TPFs), que median las respuestas inmunes a través de una variedad de mecanismos moleculares para expresar marcadores de desgranulación (CD107a) y secretar interferón (IFN)-γ, factor de necrosis tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-2 o proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1α. Cada vez hay más pruebas de que losPFT están estrechamente relacionados con el mantenimiento de la memoria y la protección inmunitaria a largo plazo y que su mayor proporción es un marcador importante de inmunidad protectora y es importante en el control efectivo de la infección viral y la reactivación. Esta evaluación se aplica no solo a respuestas inmunes específicas, sino también a la evaluación de respuestas inmunes de reacción cruzada. Aquí, tomando el virus de la encefalitis japonesa (JEV) como ejemplo, el método de detección y el esquema de color de citometría de flujo de TPFespecíficos de JEV producidos por células mononucleares de sangre periférica de niños vacunados contra la encefalitis japonesa se probaron para proporcionar una referencia para estudios similares.
Introduction
El virus de la encefalitis japonesa (JEV) es un importante virus transmitido por mosquitos perteneciente al género Flavivirus dentro de la familia Flaviviridae1. Muchos países de Asia y el Pacífico han enfrentado durante mucho tiempo enormes desafíos de salud pública debido a la enorme carga de enfermedad causada por la encefalitis japonesa (EJ), pero esto ha mejorado dramáticamente con la creciente disponibilidad de varios tipos de vacunas2. Las respuestas inmunes protectoras adaptativas evocadas por la infección natural o la vacunación contribuyen a la prevención y la regulación antiviral. La inmunidad humoral y la inmunidad mediada por células se clasifican como inmunidad adaptativa, y la inducción de la primera siempre se ha considerado como una estrategia clave en el diseño de vacunas, aunque con una comprensión relativamente limitada en los últimos3. Sin embargo, el papel de la inmunidad mediada por células T en la limitación de la diseminación del flavivirus y la eliminación del virus se ha centrado cada vez más y se ha estudiado ampliamente4. Además, la inmunidad de las células T no solo es indispensable en las respuestas antivirales específicas del JEV, sino que también desempeña un papel destacado en la protección cruzada contra la infección secundaria con flavivirus heterólogos, lo que se ha demostrado en estudios previos5. Se especula que este efecto puede pasar por alto los posibles efectos de mejora mediados por anticuerpos en la infección5. Cabe destacar que tal inmunidad de células T de reacción cruzada es importante, especialmente en ausencia de vacunas y medicamentos antivirales contra los flavivirus. Aunque se han realizado muchos estudios para determinar la contribución de las células T en la infección por JEV con respecto a las células T CD4+ y CD8+ 6,7, los respectivos linajes secretores de citoquinas y su diversificación funcional permanecen indeterminados, lo que significa que la elucidación de las funciones exactas de las células T auxiliares y asesinas se ve obstaculizada.
La escala de sus defensas antivirales determina la calidad de las respuestas de las células T. Las células T CD4+ o CD8+ que pueden conferir de manera compatible dos o más funciones, incluida la secreción de citoquinas y la desgranulación, se caracterizan como células Tpolifuncionales (T PF) tras la estimulación específica a nivel de una sola célula8. Las células T CD4+ que producen citoquinas únicas o múltiples pueden tener varios efectos y memorias inmunitarias. Por ejemplo, las células T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ tienen más probabilidades de formar una respuesta protectora efectiva a largo plazoque las células T IL-2+ CD4+ 9, que pueden usarse como un parámetro importante para evaluar el efecto de la vacunación. La frecuencia de IL-2+ IFN-γ+ linfocitos T CD4+ aumenta en pacientes con no progresión a largo plazo del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), mientras que los linfocitos T CD4+ en pacientes con progresión del SIDA son más propensos a producir IFN-γ solo debido al efecto promotor de IL-2 sobre la proliferación de linfocitos T10. Además, se demostró que un subconjunto de IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ sobrevive a largo plazo in vivo y promueve sinérgicamente la función de matar11. Aunque las células T CD8+ tienen más probabilidades de exhibir actividad citotóxica, algunas células T CD4+ también están equipadas con actividad citotóxica como expresión detectada indirectamente de moléculas CD107a de superficie12. Además, ciertos subconjuntos de células T expresan la quimiocina MIP-1α, que a menudo es secretada por monocitos para participar en el reclutamiento de neutrófilos mediado por células T13. Del mismo modo, CD8 + TPFs también se puede utilizar para caracterizar la versatilidad de los marcadores anteriores. Los estudios han demostrado que la estrategia prime-boost puede inducir eficazmente un período prolongado de efectos protectores de TPF 13, lo que puede mejorar la protección provocada por la vacunación. Una característica central en el examen del sistema inmune es la capacidad de las células T de memoria para facilitar respuestas más fuertes, más rápidas y más efectivas a los desafíos virales secundarios que las células T ingenuas. Las células T de memoria efectora (TEM) y las células T de memoria central (TCM) son subconjuntos importantes de células T que a menudo se diferencian por la expresión compuesta de CD27/CD45RO o CCR7/CD45RA14. LaCM T (CD27+ CD45RO+ o CCR7+ CD45RA-) tiende a localizarse en tejidos linfoides secundarios, mientras que laEM T (CD27- CD45RO+ o CCR7- CD45RA-) se localiza en tejidos linfoides y periféricos 15,16. LaEM T proporciona una defensa inmediata pero no sostenida, mientras quela CM T sostiene la respuesta proliferando en los órganos linfoides secundarios y generando nuevos efectores17. Por lo tanto, dado que las células de memoria pueden mediar respuestas de recuerdo específicas y eficientes a los virus, surgen preguntas sobre la contribución de este subconjunto de polifunciones.
Con el desarrollo de la tecnología de citometría de flujo, se ha vuelto común detectar simultáneamente marcadores de más de 10 grupos, fenotipos y antígenos de diferenciación, lo que es beneficioso para anotar más abundantemente las características inmunológicas funcionales en las células T individuales para reducir la mala interpretación y las dificultades en la comprensión de los fenotipos de células T. Este estudio utilizó estimulación ex vivo y citometría de flujo para analizar los perfiles de TPF en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en niños vacunados con JEV. Aplicando este enfoque, se ampliará la comprensión de la inmunidad de células T específica de JEV e incluso de reacción cruzada a corto y largo plazo inducida por la vacunación.
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Protocol
La aprobación ética para el presente estudio fue obtenida por el Comité de Ética del Hospital de Niños de Beijing, Universidad Médica Capital (Número de aprobación: 2020-k-85). Los voluntarios fueron reclutados del Hospital de Niños de Beijing, Universidad Médica Capital. Se obtuvieron muestras de sangre venosa periférica de niños aparentemente sanos (2 años de edad) que habían recibido previamente una vacuna principal y potenciada con la vacuna JE SA14-14-2 viva atenuada durante menos de medio año (niños vacunados con JE, n = 5) y niños no vacunados (6 meses de edad, n = 5). El consentimiento informado de los sujetos humanos no se aplicó ya que sólo las muestras residuales, después de ser probadas clínicamente, se utilizaron en este estudio. Para proteger la privacidad de los voluntarios, todos los datos fueron completamente anónimos y desidentificados.
1. Aislamiento de PBMC de sangre venosa periférica
- Recolectar muestras de sangre venosa periférica (2 mL) de niños vacunados y no vacunados con JE en tubos anticoagulados con EDTA-K2 (ver Tabla de Materiales) mediante la técnica estándar de venopunción18.
- Agregue 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) para diluir la sangre periférica.
NOTA: El proceso se maneja lo antes posible para mantener la máxima capacidad de supervivencia. - Agregue 4 ml del medio de gradiente de densidad (consulte la Tabla de materiales) a un tubo centrífugo de 15 ml y transfiera lentamente la sangre diluida a la capa superior del medio de separación.
NOTA: No mezcle la sangre con el medio de separación ni destruya la superficie de contacto formada por los dos líquidos; de lo contrario, no se logrará el efecto de separación. - Centrifugar a 800 × g durante 20 min a temperatura ambiente. Observe las capas significativas después de la centrifugación.
- Transfiera las PBMC (la capa intermedia) a otro tubo de centrífuga de 15 ml y lave las PBMC con 10 ml de medio RPMI-1640 que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS, consulte la Tabla de materiales).
- Centrifugar a 800 × g durante 10 min a temperatura ambiente y desechar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
- Vuelva a suspender las PBMC con 1 ml de medio RPMI-1640 que contenga 10% de FBS y cuente las células con un contador automatizado basado en azul de tripano (consulte la Tabla de materiales).
2. Estimulación de PBMCs por partículas JEV inactivadas para inducir la expresión de citoquinas
- Establecer dos subgrupos de los grupos de estimulación y control de JEV en las muestras vacunadas y no vacunadas con JE, respectivamente.
- Ajustar el número de PBMC a 2 × 106 células/ml con RPMI-1640 medio que contenga 10% de FBS, y sembrar los PBMC en placas de 24 pocillos (2 × 106 células/1 ml de medio por pocillo); Inocular tres pozos para cada grupo.
- Estimular las PBMC del grupo de estimulación JEV con partículas concentradas inactivadas de JEV 5 (2 × 105 UFP) durante 16 h a 37 °C en presencia de anticuerpos monoclonales CD28 (1 μg/mL, 1:1.000) y CD49d (1 μg/mL), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1.000) y monensina (1 μg/mL, 1:1.000). Para la tinción superficial, utilice BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000) (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: El JEV fue inactivado por irradiación UV como se describió anteriormente19. - Estimular las PBMC del grupo control sin partículas virales concentradas durante 16 h a 37 °C en presencia de anticuerpos monoclonales CD28 (1 μg/mL, 1:1.000) y CD49d (1 μg/mL, 1:1.000), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1.000) y monensina (1 μg/mL, 1:1.000). Manchar la superficie con BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000).
3. Tinción intracelular ex vivo
- Recoger la suspensión celular de cada grupo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugar a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante con una pipeta.
- Resuspender las células en 1 ml de 1x PBS, añadir colorante de viabilidad reparable (1 μL/ml, 1:1.000, ver Tabla de materiales) a la suspensión celular, e incubar durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Centrifugar a 500 × g (a temperatura ambiente) durante 5 min y retirar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 1 mL de 1x PBS. Centrifugar a 500 × g (a temperatura ambiente) durante 5 min. Deseche el sobrenadante cuidadosamente.
- Realizar tinción de marcadores de superficie celular.
- Resuspender las células en 100 μL de 1x PBS, y añadir 2 μL de cada anticuerpo de marcadores de superficie (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27, y BV480-anti-CD45RO, factor de dilución: 1:50, ver Tabla de materiales) a la suspensión celular en cada tubo.
NOTA: El protocolo de tinción de anticuerpos fluorescentes de color se muestra en la Tabla 1. - Incubar los tubos (paso 3.4.1) durante 30 min a temperatura ambiente y protegerlos de la luz. Centrifugar a 500 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
NOTA: El anticuerpo de BUV737-anti-CD27 y BV480-anti-CD45RO se puede reemplazar con BUV737-anti-CCR7 y BV480-anti-CD45RA como anotación de las células T de memoria.
- Resuspender las células en 100 μL de 1x PBS, y añadir 2 μL de cada anticuerpo de marcadores de superficie (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27, y BV480-anti-CD45RO, factor de dilución: 1:50, ver Tabla de materiales) a la suspensión celular en cada tubo.
- Resuspender las células en 1 mL de 1x PBS. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante cuidadosamente.
- Realizar fijación y rotura de membranas.
- Resuspender las células con 500 μL de solución fijadora que rompe la membrana (ver Tabla de materiales) y fijar las células durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Centrifugar a 500 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 1 mL de 1x PBS. Centrifugar durante 5 min a 500 × g a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante con cuidado.
- Realizar tinción de citoquinas intracelulares.
- Resuspender las células en 100 μL de 1x PBS y agregar 2 μL de cada anticuerpo de citoquinas (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 y APC-anti-MIP-1α, factor de dilución: 1:50, ver Tabla de materiales) a la suspensión celular en cada tubo.
NOTA: Los volúmenes y la información sobre los anticuerpos conjugados fluoróforos se muestran en la Tabla 1. - Incubar los tubos (paso 3.8.1) durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Centrifugar a 500 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 100 μL de 1x PBS y agregar 2 μL de cada anticuerpo de citoquinas (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 y APC-anti-MIP-1α, factor de dilución: 1:50, ver Tabla de materiales) a la suspensión celular en cada tubo.
- Resuspender las células en 1 mL de 1x PBS. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante con cuidado. Agregue 500 μL de 1x PBS para resuspender las células.
4. Configuración de la citometría de flujo
- Aísle la muestra PBMC sola siguiendo los procedimientos descritos en el paso 1 como muestra de control. Divida la suspensión celular en 12 partes iguales en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (100 μL/tubo) como se menciona a continuación.
- Configure tinción, APC-Cy7-vivo/muerto reparable teñido, BV650-anti-CD3 de una sola tinción, BUV395-anti-CD4 de una sola tinción, BV421-anti-CD8 de una sola tinción, BUV737-anti-CD27 de una sola tinción, BV480-anti-CD45RO teñido, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ teñido, PE-anti-TNF-α de una sola tinción, BV785-anti-IL-2 de una sola tinción y APC-anti-MIP-1α de una sola tiñida.
- Agregue los marcadores de superficie celular y la tinción de citoquinas intracelulares como se describe en el paso 3. Para cada muestra de tinción única, agregue solo uno de los fluoróforos de la etapa de tinción. Agregue 500 μL de 1x PBS para resuspender las células y el vórtice con baja velocidad.
- Usando una muestra no teñida, ajuste la dispersión directa (FSC), la dispersión lateral (SSC) y diferentes voltajes de tinte fluorescente.
NOTA: Para el presente estudio, se establecieron los siguientes voltajes. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V y BV785: 725 V. - Usando las muestras de tinción única, ajuste la compensación de citometría de flujo para eliminar las señales de contaminación entre los diferentes fluoróforos.
NOTA: Los parámetros de compensación se muestran en la Tabla 2.
5. Estrategia de gating y análisis de datos
NOTA: En el presente estudio, para este análisis, las células T de memoria central (TCM de linfocitos T CD8+ o CD4+ como CD27+ CD45RO+ o CCR7+ CD45RA- y los linfocitos T de memoria efectora (TEM) de linfocitos T CD8+ o CD4+ como CD27- CD45RO+ o CCR7- CD45RA- fueron definidos respectivamente16.
- Dibuje una puerta poligonal a través del diagrama de puntos del área FSC (FSC-A)/SSC (SC-A) para seleccionar la población de linfocitos intacta mientras se excluyen los desechos (Figura 1A).
- Dibuje una puerta rectangular a través del diagrama de puntos FSC-A/FSC-width (FSC-W) para seleccionar las celdas individuales (Figura 1B).
- Dibuje una puerta rectangular a través del diagrama de puntos vivo/muerto/SSC-A para seleccionar las celdas vivas (Figura 1C).
- Dibuje una puerta rectangular a través del diagrama de puntos CD3/SSC-A para identificar las células T CD3+ (Figura 1D).
- Dibuje una puerta cuádruple a través del diagrama de puntos CD4/CD8 para identificar las células T CD4+ o CD8+ (Figura 1E).
- Dibuje una puerta cuádruple a través del diagrama de puntos CD45RO/CD27 para subdividir las células T CD4+ o CD8+ en TCM (CD27+ CD45RO+) y TEM (CD27- CD45RO+) (Figura 1F-I).
- Dibuje las puertas de CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 y MIP-1α a partir de la TCM o TEM de las células T CD8+ o CD4+ para determinar la frecuencia de diferentes patrones de respuesta, respectivamente.
- Cargue las muestras en la citometría secuencialmente. Utilice una puerta de parada 20 para adquirir 1 ×10 6 linfocitos.
NOTA: El usuario individual puede recopilar más de 1 × 106 celdas. Este número fue un compromiso entre el tiempo necesario y la recolección de suficientes células para proporcionar resultados significativos.
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Representative Results
La Figura 1 muestra la estrategia de activación utilizada para dividirla CM T ola EM T de las células T CD8+ o CD4+ de un grupo representativo de estimulación JEV de niños vacunados con JE. El diagrama de puntos FSC-A/SSC-A se utiliza para identificar linfocitos, y el diagrama de puntos FSC-A/FSC-W se utiliza para identificar células individuales. Las células viables se seleccionan en el diagrama de puntos vivo/muerto/SSC-A. El diagrama de puntos CD3/SSC-A se utiliza para identificar las células T CD3+. El diagrama de puntos CD4/CD8 se utiliza para identificar las células T CD3+ CD4+ y CD3+ CD8+, respectivamente. ElCM T (CD27+ CD45RO+) y elEM T (CD27- CD45RO+) de los linfocitos T CD8+ o CD4+ se seleccionan por separado en el diagrama de puntos CD45RO/CD27. Las células con el fenotipo CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ y MIP-1α+ de CD8+ T CM (Figura 1F), CD8+ T EM (Figura 1G), CD4+ TCM (Figura 1H) y CD4+ T EM (Figura 1I) se seleccionan por separado dibujando la puerta rectangular correspondiente.
La caracterización polifuncional de las respuestas de las células T CD4+ y CD8+ de memoria central y efectora (incluyendo desgranulación, citoquinas y quimiocinas) a JEV en niños vacunados con JE y no vacunados se muestra en la Tabla 3. Estos resultados indican que se detectaron niveles elevados de CD107a, IFN-γ, TNF-α e IL-2 en las células CD8+ TCM de los niños vacunados después de la estimulación JEV en comparación con los de los niños no vacunados. El nivel de MIP-1α no difirió entre los dos grupos. Se cree que las célulasT EM ejercen efectos antivirales directamente después de la reestimulación con JEV. Se detectaron niveles más altos de CD107a e IFN-γ en las célulasT EM CD8 + del grupo vacunado bajo estimulación JEV en comparación con el grupo no vacunado. Sin embargo, TNF-α, IL-2 y MIP-1α no estaban significativamente elevados en esas células positivas.
El antígeno JEV indujo con éxito niveles más altos de CD107a, IFN-γ, TNF-α y MIP-1α en las células TCM CD4 + del grupo vacunado en comparación con el grupo no vacunado. Sin embargo, la proporción de células IL-2+ no difirió entre los dos grupos bajo estimulación JEV. La proporción de los subconjuntos CD107a+, IFN-γ+ y TNF-α+ de células TEM CD4+ en el grupo vacunado fue mayor en presencia de JEV que en el grupo no vacunado.
Figura 1: Ilustración de la estrategia de compuerta para identificar el TCM o TEM de linfocitos T CD8+ o CD4+ y sus subconjuntos. (A) Los linfocitos se identificaron utilizando el diagrama de puntos FSC-A/SSC-A. (B) Las células individuales se identificaron utilizando el diagrama de puntos FSC-A / FSC-W. (C) Las células vivas se identificaron utilizando el diagrama de puntos vivo/muerto/SSC-A. (D) Las células T CD3+ se identificaron utilizando el diagrama de puntos CD3/SSC-A. (E) Las células T CD3+ CD4+ y CD3+ CD8+ se identificaron mediante el diagrama de puntos CD4/CD8. (F) CD8+ TCM con el fenotipo de CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ y MIP-1α+ se subdividieron por separado. (G) CD8+ TEM con los cinco fenotipos se subdividieron por separado. (H) CD4+ TCM con los cinco fenotipos se subdividieron por separado. (I) LaEM T CD4+ con los cinco fenotipos se subdividió por separado. Los números en cada panel representan el porcentaje de celdas en las puertas. El código de colores representa la frecuencia de aparición de las células, donde el rojo es la frecuencia más alta y el azul es el más bajo. Abreviaturas: SSC-A = área de dispersión lateral; FSC-A = área de dispersión hacia adelante; FSC-W = ancho de dispersión hacia adelante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Diana de anticuerpos | Fluoróforo conjugado | Dosificación | Clon | Isotipo | Línea láser de excitación | Ex-Max (nm) | Em-Max (nm) |
| CD3 | BV650 | 2 μL | SK7 | Ratón IgG1, κ | Violeta | 407 | 650 |
| CD4 | BUV395 | 2 μL | SK3 | Ratón IgG1, κ | UV | 348 | 39 |
| CD8 | BV421 | 2 μL | SK1 | Ratón IgG1, κ | Violeta | 407 | 421 |
| CD27 | BUV737 | 2 μL | L128 | Ratón IgG1, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RO | BV480 | 2 μL | UCHL1 | Ratón IgG2a, κ | Violeta | 436 | 478 |
| CCR7 | BUV737 | 2 μL | 3D12 | Rata IgG2a, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RA | BV480 | 2 μL | HI100 | Ratón IgG2b, κ | Violeta | 436 | 478 |
| CD107a | BV605 | 2 μL | H4A3 | Ratón IgG1, κ | Violeta | 407 | 602 |
| IL-2 | BV785 | 2 μL | MQ1-17H12 | Rata IgG2a, κ | Violeta | 407 | 786 |
| IFN-γ | FITC | 2 μL | 4S. B3 | Ratón IgG1, κ | Azul | 494 | 520 |
| TNF-α | PEI | 2 μL | MAb11 | Ratón IgG1, κ | Amarillo-Verde | 496, 564 | 578 |
| MIP-1α | APC | 2 μL | 11A3 | Ratón IgG2a, κ | Rojo | 650 | 660 |
| Zombie NIR | APC-Cy7 | 1 μL | - | - | Rojo | 650 | 779 |
Tabla 1: Protocolo de tinción de anticuerpos fluorescentes de color para análisis citométricos de flujo. Abreviaturas: BV = violeta brillante; BUV = ultravioleta brillante; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina.
| Referencia de compensación de la citometría de flujo (%) | ||||||||||||
| FITC | APC | APC-Cy7 | BV421 | BV480 | BV605 | BV560 | BV785 | BUV395 | BUV737 | PEI | ||
| FITC | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC-Cy7 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 65 | 0 | 44 | 0 | |
| BV421 | 0 | 0.6 | 0 | 100 | 10.5 | 3 | 15 | 3 | 0.4 | 0 | 0 | |
| BV480 | 3 | 0 | 0 | 46 | 100 | 19 | 0 | 6.1 | 0 | 0 | 0 | |
| BV605 | 0 | 0 | 0 | 3.6 | 0 | 100 | 94 | 10 | 0 | 9 | 14 | |
| BV560 | 0 | 5.5001 | 0 | 2 | 1 | 7.1 | 100 | 9 | 0 | 10 | 0 | |
| BV785 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 30 | 0 | |
| BUV395 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | |
| BUV737 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.7001 | 3 | 100 | 0 | |
| PEI | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
Tabla 2: Los parámetros de compensación para los análisis citométricos de flujo. Abreviaturas: BV = violeta brillante; BUV = ultravioleta brillante; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina.
| Grupo de TPF | Caracterización polifuncional (%) | |||||||
| Estímulo | CD107a | IFN-γ | TNF-α | IL-2 | MIP-1α | |||
| Células T CD8+ | TCM | Vacunada | JEV | 1.50±0.48 | 1.60±0.69 | 0,66±0,32 | 0,54±0,27 | 0.16±0.11 |
| Ctrl | 0,51±0,38 | 0.31±0.13 | 0.28±0.13 | 0.37±0.20 | 0.02±0.05 | |||
| No vacunado | JEV | 0.38±0.19 | 0.20±0.03 | 0.19±0.09 | 0.16±0.04 | 0.19±0.09 | ||
| Ctrl | 0,50±0,28 | 0.27±0.09 | 0.19±0.05 | 0,23±0,14 | 0.08±0.11 | |||
| Valor de p* | - | 0.00 | 0.00 | 0.02 | 0.01 | 0.70 | ||
| TEM | Vacunada | JEV | 1.47±0.58 | 1.21±0.22 | 0,49±0,36 | 0.33±0.31 | 0.24±0.17 | |
| Ctrl | 0,82±0,48 | 0.39±0.15 | 0.16±0.18 | 0,23±0,256 | 0.09±0.21 | |||
| No vacunado | JEV | 0,41±0,25 | 0.14±0.09 | 0.15±0.11 | 0.20±0.07 | 0.15±0.13 | ||
| Ctrl | 0.34±0.13 | 0.21±0.15 | 0.17±0.10 | 0.19±0.19 | 0.01±0.02 | |||
| Valor de p* | - | 0.01 | 0.00 | 0.08 | 0.13 | 0.36 | ||
| Células T CD4+ | TCM | Vacunada | JEV | 1.55±0.43 | 1.16±0.24 | 0,57±0,25 | 0.29±0.18 | 0.19±0.07 |
| Ctrl | 0,44±0,27 | 0.26±0.20 | 0.15±0.06 | 0.12±0.06 | 0.04±0.07 | |||
| No vacunado | JEV | 0.28±0.08 | 0.21±0.08 | 0.17±0.03 | 0.21±0.16 | 0.10±0.03 | ||
| Ctrl | 0.31±0.13 | 0.26±0.06 | 0.14±0.04 | 0,25±0,13 | 0.04±0.04 | |||
| Valor de p* | - | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.47 | 0.04 | ||
| TEM | Vacunada | JEV | 1.54±0.58 | 1.33±0.15 | 0,89±0,25 | 0,37±0,22 | 0.21±0.05 | |
| Ctrl | 0.46±0.49 | 0.35±0.30 | 0.13±0.08 | 0.14±0.09 | 0.05±0.11 | |||
| No vacunado | JEV | 0.27±0.09 | 0.23±0.10 | 0.30±0.15 | 0.23±0.03 | 0.14±0.06 | ||
| Ctrl | 0,35±0,21 | 0,24±0,14 | 0.19±0.20 | 0.25±0.08 | 0.05±0.07 | |||
| Valor de p* | - | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.19 | 0.08 | ||
| * Prueba U de Mann-Whitney, PBMC de individuos vacunados estimulados por JEV vs. Solo se mostraron PBMC de individuos no vacunados estimulados por JEV. | ||||||||
Tabla 3: Caracterización polifuncional de las respuestas de los linfocitos TCM y TT CD4+ o CD8+ a la VEV. Vacunados, n = 5; no vacunados, n = 5. Los resultados se expresan como media ± DE. P < 0,05 indicaron una diferencia significativa. * Se muestran las PBMC de individuos vacunados estimulados por JEV versus PBMC de individuos no vacunados estimulados solo por JEV. Abreviaturas: TPFs = células T polifuncionales; IFN-γ = interferón-γ; TNF-α = factor de necrosis tumoral α; IL-2 = interleucina-2; MIP-1α = proteína inflamatoria de macrófagos-1α; TCM = células T de memoria central; TEM = células T de memoria efectora.
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Discussion
Este protocolo representa un método de detección factible basado en citometría de flujo para perfiles deT PF en las PBMC de niños vacunados con la vacuna JEV SA14-14-2. Este estudio utilizó las PBMC de sangre venosa de niños vacunados y no vacunados como materiales de investigación. Con la estimulación de PBMC con el antígeno JEV, esos antígenosT PFespecíficos amplificados pueden caracterizarse por tinción de anticuerpos de citometría de flujo multicolor. En comparación con el método convencional de ensayo inmunospot ligado a enzimas, la ventaja sobresaliente de la citometría de flujo es presentar las características funcionales de las PBMC a nivel de una sola célula de la manera más diversa posible, reduciendo el número de PBMC requeridas para la detección, lo que es especialmente adecuado para los niños.
Un historial de vacunación claro, viabilidad celular mantenida, la inmunogenicidad de las células T del estimulador y estrategias de coincidencia de color compatibles son pasos críticos en este protocolo. China ha incorporado la vacunación de JEV SA14-14-2 en el programa nacional ampliado de inmunización desde 2008 y ha incluido el historial de vacunación en la gestión unificada, que está disponible para la accesibilidad del historial de vacunas3. Los PBMC examinados en este protocolo se mantuvieron experimentalmente en hielo para mantener la máxima viabilidad celular. El uso de estímulos específicos ha demostrado previamente ser eficaz 4,5,21,22. La estrategia de coincidencia de color es la principal restricción en este método, y la usabilidad de esta estrategia se ha presentado en el refinamiento continuo previo a la prueba y la coincidencia de parámetros del instrumento. Además, este protocolo proporcionaba dos opciones para anotar las células T de memoria. A través de la configuración anterior y la optimización de los parámetros experimentales, podría ser posible medir la inmunidad específica e incluso de reacción cruzada mediante la evaluación de la escala y la frecuencia de las respuestas de TPF a la vacunación por citometría de flujo. Sin embargo, los cinco indicadores representativos para caracterizar TPFs son una limitación de este estudio; las moléculas funcionales actualmente comunes (CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 y MIP-1α) pueden ampliarse para detectar el espectro con el fin de caracterizar más completamente la versatilidad de TPFs basado en el protocolo presentado.
La infección por JEV se considera una enfermedad prevenible por vacunación en la que las respuestas de las células T de memoria evocadas por la vacunación pueden ser críticas para mantener una protección inmune duradera, especialmente a medida que las respuestas de anticuerpos disminuyen con el tiempo4. Como principal componente protector totipotente en las células T de memoria, lasPFT deben sugerirse como un elemento de prueba de rutina para la evaluación de la eficacia de la vacuna y, a la inversa, guiar el diseño y desarrollo de vacunas de células T dirigidas. De hecho, el papel de la inmunidad de las células T en el control de la infección por flavivirus se está apreciando cada vez más, e incluso puede pasar por alto el papel de los anticuerpos para bien o para mal5. La aclaración del perfil deT PF sin duda reducirá aún más el repertorio de epítopos antigénicos, lo que seguramente reducirá el costo de las vacunas al mejorar la focalización. Los efectos sinérgicos de las células T CD4+ y CD8+ se complementan entre sí y son indudablemente más prominentes en lasPFT. Por lo tanto, se propone que los estudios sobrePF T se centren en (1) las diferencias de perfil entre lasPFT a largo y corto plazo; (2) la identificación de epítopos TPF restringidos por HLA; y (3) la exploración e investigación de más subpoblaciones polifuncionales.
La identificación de células TPF en el control inmune de la infección viral había sido reportada23,24,25. Sin embargo, la descripción de la estrategia y el proceso de detección completos deT PFs no ha sido bien organizada. Además, el esquema de color de este método se aplica a múltiples modelos de citómetros de flujo. Los marcadores también se pueden ajustar para detectar otros subgrupos funcionales en función de esta coincidencia de color.
Este estudio proporcionó una estrategia de detección de PF T al combinar estimulación específica ex vivo y citometría de flujo para analizar los perfiles de subconjuntos dePF T en las PBMC de los receptores de la vacuna JEV. Las PBMC aisladas se estimularon primero con el antígeno JEV y luego se tiñeron con los correspondientes anticuerpos marcados con fluorescencia, y los PF de memoria CD4+ y CD8+ específicos deJEV se caracterizaron mediante citometría de flujo. Sobre la base de este resultado, las frecuencias de T PF de funciones dobles, triples, cuádruples y quíntuples se pueden calcularaún más para describir TPF s con más detalle y de manera más completa. Se ha demostrado que los volúmenes sanguíneos venosos de rutina (2 ml) en niños son suficientes para los estudios dePF T. Por lo tanto, se espera que los métodos de detección dePFT específicas del virus se utilicen para explorar medidas de inmunidad adaptativa mediada por células T asociada con la vacunación o la infección.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
R.W. fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82002130), la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing de China (7222059). ZD.X. fue apoyado por el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
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