Usando um modelo de camundongo com doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) induzida por dieta, descrevemos o uso de novas técnicas de microtomografia computadorizada in vivo como um método não invasivo para avaliar os estágios de progressão da DHGNA, enfocando predominantemente a rede vascular hepática devido ao seu envolvimento significativo na desregulação hepática relacionada à DHGNA.
A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é um crescente problema de saúde global, e o impacto da DHGNA é agravado pela atual falta de tratamentos eficazes. Consideráveis fatores limitantes que dificultam o diagnóstico oportuno e preciso (incluindo a graduação) e o monitoramento da DHGNA, bem como o desenvolvimento de potenciais terapias, são as atuais inadequações na caracterização da estrutura do microambiente hepático e na pontuação do estágio da doença de forma espaço-temporal e não invasiva. Usando um modelo de camundongo com DHGNA induzida por dieta, investigamos o uso de técnicas de imagem de microtomografia computadorizada (TC) in vivo como um método não invasivo para avaliar os estágios de progressão da DHGNA, enfocando predominantemente a rede vascular hepática devido ao seu envolvimento significativo na desregulação hepática relacionada à DHGNA. Essa metodologia de imagem permite a análise longitudinal da esteatose hepática e da captação tecidual funcional, bem como a avaliação do volume sanguíneo relativo, do diâmetro da veia porta e da densidade da rede vascular. Compreender as adaptações da rede vascular hepática durante a progressão da DHGNA e correlacioná-la com outras formas de caracterizar a progressão da doença (esteatose, inflamação, fibrose) usando o método proposto pode abrir caminho para o estabelecimento de novas abordagens, mais eficientes e reprodutíveis para a pesquisa da DHGNA em camundongos. Espera-se também que este protocolo atualize o valor dos modelos animais pré-clínicos para investigar o desenvolvimento de novas terapias contra a progressão da doença.
A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é uma doença metabólica que afeta aproximadamente 25% da população e >80% das pessoas obesas mórbidas1. Estima-se que um terço desses indivíduos evolua para esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), que se caracteriza por esteatose hepática, inflamação e fibrose2. A EHNA é um estágio da doença com risco significativamente maior para o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC)3,4. Por essa razão, a EHNA é atualmente a segunda causa mais comum de transplante hepático, e espera-se que em breve se torne o mais importante preditor de transplante hepático 5,6,7. Apesar de sua prevalência e gravidade, nenhuma terapia doença-específica está disponível para a DHGNA, e os tratamentos existentes visam apenas combater patologias associadas à doença, como resistência insulínica e hiperlipidemia 5,6.
Nos últimos anos, o papel fisiopatológico e as adaptações do endotélio e, em geral, da rede vascular de tecidos metabólicos, como o tecido adiposo e o fígado, vêm ganhando maior importância nas pesquisas, principalmente durante a obesidade e a desregulaçãometabólica7,8. O endotélio é uma monocamada celular que reveste internamente a rede vascular, atuando como barreira funcional e estrutural. Também contribui para vários processos fisiológicos e patológicos, como trombose, transporte de metabólitos, inflamação e angiogênese 9,10. No caso do fígado, a rede vascular caracteriza-se, entre outras características, pela presença de células altamente especializadas, definidas como células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs). Essas células não possuem membrana basal e possuem múltiplas fenestras, permitindo a transferência mais fácil de substratos entre o parênquima sanguíneo e hepático. Devido à sua localização anatômica e características distintas, os LSECs provavelmente têm um papel crucial nos processos fisiopatológicos do fígado, incluindo o desenvolvimento de inflamação e fibrose hepática durante a DHGNA/EHNA. De fato, as adaptações patológicas, moleculares e celulares que os LSECs sofrem no curso da DHGNA contribuem para a progressão da doença11. Especificamente, a angiogênese hepática dependente de LSEC que ocorre durante a DHGNA está significativamente associada ao desenvolvimento de inflamação e à progressão da doença para EHNA ou mesmo CHC12. Além disso, a DHGNA precoce relacionada à obesidade é caracterizada pelo desenvolvimento de resistência insulínica nos LSECs, que precede o desenvolvimento de inflamação hepática ou outros sinais avançados de DHGNA13.
Além disso, os LSECs emergiram recentemente como reguladores centrais do fluxo sanguíneo hepático e adaptações da rede vascular durante doenças hepáticas de diversas etiologias14,15. De fato, a doença hepática crônica é caracterizada por proeminente vasoconstrição intra-hepática e aumento da resistência ao fluxo sanguíneo, que contribuem para o desenvolvimento da hipertensão portal16. No caso da DHGNA, vários mecanismos relacionados à LSEC contribuem para esse fenômeno. Por exemplo, a resistência insulínica específica para LSC, como mencionado acima, está associada à redução da vasodilatação insulino-dependente da vasculatura hepática13. Além disso, com o curso da doença, a vasculatura hepática torna-se mais sensível aos vasoconstritores, contribuindo ainda mais para o comprometimento do fluxo sanguíneo hepático e levando ao surgimento de estresse de cisalhamento, que resultam em ruptura da microcirculação sinusoidal17. Esses fatos sugerem que a vasculatura é um alvo chave na doença hepática. No entanto, fatores limitantes que dificultam o diagnóstico e o monitoramento oportunos da DHGNA/EHNA, bem como o desenvolvimento de potenciais terapias, são as inadequações na caracterização consistente do microambiente hepático e da estrutura (micro)vascular, bem como a pontuação do estágio da doença de forma espaço-temporal e não invasiva.
A microtomografia computadorizada (TC) é atualmente o método de imagem não invasivo padrão-ouro para retratar com precisão informações anatômicas dentro de um organismo vivo. A micro-TC e a RM representam dois métodos de imagem complementares que podem cobrir uma vasta gama de patologias e fornecer resolução e detalhes excepcionais nas estruturas e tecidos imageados. A micro-TC, em particular, é uma ferramenta muito rápida e precisa, sendo frequentemente utilizada para estudar patologias como doenças ósseas e alterações da superfície óssea associadas18, avaliar a progressão da fibrose pulmonar ao longo dotempo19, diagnosticar câncer de pulmão e seuestadiamento20, ou mesmo examinar patologiasdentárias21, sem qualquer preparo especial (ou destruição) das amostras que estão sendo analisadas.
A tecnologia de imagem da micro-TC baseia-se nas diferentes propriedades de atenuação de vários órgãos em termos de interação dos raios X com a matéria. Órgãos com altas diferenças de atenuação radiográfica são representados com alto contraste nas imagens de TC (ou seja, os pulmões parecem escuros e os ossos claros). Órgãos com propriedades atenuantes muito semelhantes (diferentes tecidos moles) são difíceis de distinguir nas imagens de TC22. Para resolver essa limitação, agentes de contraste especializados à base de iodo, ouro e bismuto têm sido extensivamente investigados para uso in vivo . Esses agentes alteram as propriedades atenuantes dos tecidos nos quais se acumulam, são eliminados lentamente da circulação e permitem a opacificação uniforme e estável de todo o sistema vascular ou tecidosescolhidos 23.
No diagnóstico humano, a TC e técnicas comparáveis, como a fração gorda de densidade de prótons derivada da RM, já são utilizadas para a determinação do conteúdo de gordura hepática24,25. No contexto da DHGNA, o alto contraste de partes moles é essencial para distinguir com precisão lesões patológicas ou pequenos vasos. Para isso, são utilizados agentes de contraste que proporcionam maior contraste nas características do tecido hepático. Tais ferramentas e materiais permitem o estudo de múltiplas características hepáticas e possíveis expressões patológicas, tais como a arquitetura e densidade da rede vascular, deposição/esteatose lipídica e captação tecidual funcional/transferência de lipídios (quilomícrons) no fígado. Além disso, o volume sanguíneo relativo hepático e o diâmetro da veia porta também podem ser avaliados. Em um tempo de exame muito curto, todos esses parâmetros fornecem informações diferentes e complementares sobre a avaliação e a progressão da DHGNA, que podem ser usadas para desenvolver um diagnóstico não invasivo e detalhado.
Neste artigo, apresentamos um protocolo passo a passo para o uso de novas técnicas de imagem por micro-TC in vivo como um método não invasivo para avaliar os estágios de progressão da DHGNA. Por meio desse protocolo, a análise longitudinal da esteatose hepática e da captação tecidual funcional, bem como a avaliação do volume sanguíneo relativo, diâmetro da veia porta e densidade da rede vascular, podem ser realizadas e aplicadas em modelos murinos de hepatopatia.
O método atualmente recomendado para o diagnóstico e estadiamento da DHGNA em humanos é a biópsia hepática, que abriga o risco de complexidades hemorrágicas, bem como imprecisões deamostragem40. Ao contrário, em modelos animais, esse diagnóstico é realizado por histologia post-mortem, embora protocolos para biópsia hepática de sobrevivência já estejam disponíveis e sejam recomendados quando o desenho do estudopermitir41. O uso da histologia post-mortem signif…
The authors have nothing to disclose.
A Figura 1 foi criada com BioRender.com. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Helênica para Pesquisa e Inovação (#3222 a A.C.). Anna Hadjihambi é financiada pelo Instituto Roger Williams de Hepatologia, Fundação para Pesquisa do Fígado.
eXIA160 | Binitio Biomedical, Inc. | https://www.binitio.com/?Page=Products | |
High fat diet with 60% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12492 | |
High-fructose corn syrup | Best flavors, CA | hfcs-1gallon | |
Lacrinorm ophthalmic ointment | Bausch & Lomb | ||
Normal diet with 10% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12450 | |
Viscover ExiTron nano 12000 | Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-698 | |
VivoQuant | Invicro | ||
X-CUBE | Molecubes, Belgium | https://www.molecubes.com/systems/ |