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Biologia

비알코올성 지방간 질환의 진행을 평가하기 위한 새로운 생체 내 미세 컴퓨터 단층 촬영 이미징 기술

Published: March 24, 2023
doi:
10.3791/64838
, , , , ,
1The Roger Williams Institute of Hepatology London,Foundation for Liver Research, 2Faculty of Life Sciences and Medicine,King’s College London, 3Department of Physiology, Medical School,National and Kapodistrian University of Athens, 4BIOEMTECH,Lefkippos Attica Technology Park NCSR “Demokritos”

Summary

식이 유발 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 마우스 모델을 사용하여 NAFLD의 진행 단계를 평가하기 위한 비침습적 방법으로 새로운 생체 내 미세 컴퓨터 단층 촬영 이미징 기술의 사용을 설명하며, NAFLD 관련 간 조절 장애에 크게 관여하기 때문에 주로 간 혈관 네트워크에 초점을 맞춥니다.

Abstract

비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 전 세계적으로 증가하는 건강 문제이며 NAFLD의 영향은 현재 효과적인 치료법의 부족으로 인해 더욱 악화되고 있습니다. NAFLD의 시기 적절하고 정확한 진단(등급 지정 포함) 및 모니터링과 잠재적 치료법의 개발을 방해하는 상당한 제한 요소는 간 미세 환경 구조의 특성화와 시공간 및 비침습적 방식으로 질병 단계의 채점의 현재 부적절함입니다. 식이 유도 NAFLD 마우스 모델을 사용하여 NAFLD의 진행 단계를 평가하기 위한 비침습적 방법으로 생체 내 미세 컴퓨터 단층 촬영(CT) 이미징 기술의 사용을 조사했으며, NAFLD 관련 간 조절 장애에 크게 관여하기 때문에 주로 간 혈관 네트워크에 초점을 맞췄습니다. 이 이미징 방법론을 통해 간 지방증 및 기능적 조직 흡수의 종단 분석은 물론 상대적인 혈액량, 문맥 직경 및 혈관 네트워크 밀도를 평가할 수 있습니다. NAFLD 진행 동안 간혈관 네트워크의 적응을 이해하고 이를 제안된 방법을 사용하여 질병 진행(지방증, 염증, 섬유증)을 특성화하는 다른 방법과 연관시키면 생쥐의 NAFLD 연구를 위한 새롭고 보다 효율적이며 재현 가능한 접근 방식을 확립하는 길을 열 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 질병 진행에 대한 새로운 치료법의 개발을 조사하기 위한 전임상 동물 모델의 가치를 업그레이드할 것으로 예상됩니다.

Introduction

비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 인구의 약 25%와 병적 비만인의 >80%에 영향을 미치는 대사성 질환입니다1. 이들 중 약 1/3은 간 지방증, 염증 및 섬유증을 특징으로 하는 비알코올성 지방간염(NASH)으로 진행된다2. NASH는 간경변 및 간세포 암종(HCC)의 발병 위험이 상당히 높은 질병 단계입니다.3,4. 이러한 이유로 NASH는 현재 간 이식의 두 번째로 흔한 원인이며 곧 간 이식의 가장 중요한 예측 인자 5,6,7가 될 것으로 예상됩니다. 유병률과 중증도에도 불구하고 NAFLD에 사용할 수 있는 질병 특이적 치료법은 없으며 기존 치료법은 인슐린 저항성 및 고지혈증과 같은 질병 관련 병리를 해결하는 것만을 목표로 합니다 5,6.

최근 몇 년 동안, 내피의 병태생리학적 역할과 적응, 그리고 일반적으로 지방 조직 및 간과 같은 대사 조직의 혈관 네트워크의 적응은 특히 비만 및 대사 조절 장애 동안 연구에서 더욱 중요해지고 있습니다 7,8. 내피는 내부적으로 혈관 네트워크를 둘러싸고 있는 세포 단층으로 기능적 및 구조적 장벽 역할을 합니다. 또한 혈전증, 대사 산물 수송, 염증 및 혈관 신생과 같은 다양한 생리 학적 및 병리학 적 과정에 기여합니다 9,10. 간의 경우, 혈관 네트워크는 다른 특징들 중에서도 간 정현파 내피 세포 (LSEC)로 정의되는 고도로 전문화 된 세포의 존재를 특징으로합니다. 이 세포에는 기저막이 없고 여러 개의 회향부가 있어 혈액과 간 실질 사이의 기질을 더 쉽게 전달할 수 있습니다. 독특한 해부학적 위치와 특성으로 인해 LSEC는 NAFLD/NASH 동안 간 염증 및 섬유증의 발병을 포함하여 간의 병태생리학적 과정에서 중요한 역할을 할 가능성이 높습니다. 실제로, LSEC가 NAFLD 과정에서 겪는 병리학적, 분자적, 세포적 적응은 질병 진행에 기여한다11. 특히, NAFLD 동안 발생하는 LSEC 의존성 간 혈관 신생은 염증의 발병 및 NASH 또는 HCC12로의 질병 진행과 유의하게 관련이 있습니다. 게다가, 비만 관련 초기 NAFLD는 LSEC에서 인슐린 저항성의 발달을 특징으로 하며, 이는 간 염증 또는 기타 진행된 NAFLD 징후의 발병에 선행한다13.

또한, LSEC는 최근 여러 병인의 간 질환 동안 간 혈류 및 혈관 네트워크 적응의 중심 조절자로 부상했다14,15. 실제로 만성 간질환은 현저한 간내 혈관 수축과 혈류에 대한 저항성 증가를 특징으로 하며, 이는 문맥압항진증의 발병에 기여한다16. NAFLD의 경우 여러 LSEC 관련 메커니즘이 이러한 현상에 기여합니다. 예를 들어, LSEC 특이적 인슐린 저항성은 상기 언급된 바와 같이 간 맥관 구조의 인슐린 의존성 혈관 확장 감소와 관련이 있다13. 게다가, 질병이 진행되는 동안 간 혈관 구조는 혈관 수축 물질에 더 민감해져서 간 혈류의 손상에 더욱 기여하고 전단 응력의 출현으로 이어지며, 이는 둘 다 정현파 미세순환을 방해한다17. 이러한 사실은 맥관 구조가 간 질환의 핵심 표적임을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 NAFLD/NASH의 적시 진단 및 모니터링과 잠재적 치료법의 개발을 방해하는 제한 요인은 간 미세 환경 및 (미세)혈관 구조의 일관된 특성화의 부적절함과 시공간 및 비침습적 방식으로 질병 단계의 점수 매기기.

마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT) 영상은 현재 살아있는 유기체 내의 해부학적 정보를 정확하게 묘사하기 위한 표준 비침습적 영상 방법입니다. Micro-CT와 MRI는 광범위한 병리를 포괄할 수 있고 영상화된 구조와 조직에서 탁월한 해상도와 디테일을 제공할 수 있는 두 가지 보완적인 영상 방법을 나타냅니다. 특히 마이크로 CT는 매우 빠르고 정확한 도구로, 뼈 질환 및 관련 골 표면 변화18와 같은 병리를 연구하고, 시간 경과에 따른 폐 섬유증의 진행을 평가하며19, 폐암과 그 병기20를 진단하고, 심지어 치과 병리21를 검사하는 데에도 자주 사용되며, 영상화되는 샘플의 특별한 준비(또는 파괴)가 없다.

micro-CT의 이미징 기술은 X선과 물질의 상호 작용 측면에서 다양한 장기의 다양한 감쇠 특성을 기반으로 합니다. 높은 X선 감쇠 차이를 나타내는 장기는 CT 이미지에서 높은 대비로 묘사됩니다(즉, 폐는 어둡고 뼈는 밝게 나타남). 매우 유사한 감쇠 특성(다른 연조직)을 나타내는 장기는 CT 영상에서 구별하기 어렵다22. 이러한 한계를 해결하기 위해 요오드, 금 및 비스무트를 기반으로 하는 특수 조영제가 생체 내 사용을 위해 광범위하게 조사되었습니다. 이들 작용제는 축적된 조직의 감쇠 특성을 변화시키고, 순환계에서 서서히 제거되며, 전체 혈관계 또는 선택된 조직의 균일하고 안정적인 혼탁을 가능하게 한다23.

인간 진단에서 CT 영상 및 MRI 유래 양성자 밀도 지방 분율과 같은 유사한 기술은 이미 간 지방 함량24,25의 측정에 사용되고 있습니다. NAFLD의 맥락에서 높은 연조직 대비는 병리학적 병변이나 작은 혈관을 정확하게 구별하는 데 필수적입니다. 이를 위해, 간 조직 특성의 향상된 조영제를 제공하는 조영제가 활용된다. 이러한 도구와 재료를 사용하면 혈관 네트워크의 구조 및 밀도, 지질 침착/지방증, 간에서 기능적 조직 흡수/지질(유미미크론) 전달과 같은 여러 간 특성 및 가능한 병리학 발현을 연구할 수 있습니다. 또한 간 상대 혈액량과 문맥 직경도 평가할 수 있습니다. 매우 짧은 스캔 시간에 이러한 모든 매개변수는 NAFLD의 평가 및 진행에 대한 다양하고 보완적인 정보를 제공하며, 이는 비침습적이고 상세한 진단을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.

이 기사에서는 NAFLD의 진행 단계를 평가하기 위한 비침습적 방법으로 새로운 생체 내 마이크로 CT 이미징 기술을 사용하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여 간 지방증 및 기능적 조직 흡수의 종단 분석뿐만 아니라 상대 혈액량, 문맥 직경 및 혈관 네트워크의 밀도를 평가하여 간 질환의 마우스 모델에 적용하고 적용할 수 있습니다.

Protocol

모든 절차는 유럽 및 국가 복지 규정에 따라 BIOEMTECH의 직원에 의해 수행되었으며 국가 당국의 승인을 받았습니다(라이센스 번호 EL 25, BIOexp 45/PN 49553, 21/01/20). 모든 실험은 ARRIVE 지침26을 준수하여 설계 및 보고되었습니다. 마우스는 그리스 아테네에 있는 그리스 파스퇴르 연구소에서 구입하였다. 참고: 동물들은 상대 습도가 50%-60%이고 12시간의 명암 주기(밝?…

Representative Results

이 대표적인 연구에서 조영제가 없는 마이크로 CT 영상은 대조군에 비해 NAFLD가 있는 마우스에서 간 지방 비율이 더 높은 것으로 나타났으며(표 2), 병리를 확인했습니다. 위에서 설명한 ExiTron 조영제와 간혈관 네트워크 구조 및 밀도 분석을 사용하여 간혈관 네트워크의 총 부피 밀도는 건강한 대조군에 비해 NAFLD가 있는 마우스에서 더 높은 것으로 나타났습니다(그림 6</…

Discussion

인간의 NAFLD 진단 및 병기 결정에 현재 권장되는 방법은 간 생검으로, 출혈 복잡성의 위험이 있을 뿐만 아니라 샘플링 부정확성40. 반대로, 동물 모델에서 이러한 진단은 사후 조직학에 의해 수행되지만, 생존 가능한 간 생검에 대한 프로토콜이 현재 이용 가능하고 연구 설계가 허용 할 때 권장된다41. 사후 조직학의 사용은 이 질병의 진행을 조사하기 위해 많은 ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

그림 1 은 BioRender.com 사용하여 작성되었습니다. 이 작업은 그리스 연구 및 혁신 재단(#3222 to A.C.)의 지원을 받았습니다. Anna Hadjihambi는 간 연구 재단 인 Roger Williams Institute of Hepatology에서 자금을 지원합니다.

Materials

eXIA160 Binitio Biomedical, Inc. https://www.binitio.com/?Page=Products
High fat diet with 60% of kilocalories from fat Research Diets, New Brunswick, NJ, USA D12492
High-fructose corn syrup  Best flavors, CA hfcs-1gallon
Lacrinorm ophthalmic ointment  Bausch & Lomb
Normal diet with 10% of kilocalories from fat  Research Diets, New Brunswick, NJ, USA D12450
Viscover ExiTron nano 12000  Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-095-698
VivoQuant Invicro
X-CUBE  Molecubes, Belgium https://www.molecubes.com/systems/
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Hadjihambi, A., Velliou, R., Tsialios, P., Legaki, A., Chatzigeorgiou, A., Rouchota, M. G. Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. J. Vis. Exp. (193), e64838, doi:10.3791/64838 (2023).
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