Новые методы микрокомпьютерной томографии in vivo для оценки прогрессирования неалкогольной жировой болезни печени

Summary

Используя модель мышей с неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП), вызванной диетой, мы описали использование новых методов микрокомпьютерной томографии in vivo в качестве неинвазивного метода оценки стадий прогрессирования НАЖБП, уделяя особое внимание сосудистой сети печени из-за ее значительного участия в дисрегуляции печени, связанной с НАЖБП.

Abstract

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является растущей глобальной проблемой здравоохранения, и воздействие НАЖБП усугубляется отсутствием эффективных методов лечения. Существенными ограничивающими факторами, препятствующими своевременной и точной диагностике (включая классификацию) и мониторингу НАЖБП, а также разработке потенциальных методов лечения, являются существующие недостатки в характеристике структуры микроокружения печени и оценке стадии заболевания пространственно-временным и неинвазивным способом. Используя модель мышей с НАЖБП, индуцированной диетой, мы исследовали использование методов микрокомпьютерной томографии (КТ) in vivo в качестве неинвазивного метода оценки стадий прогрессирования НАЖБП, уделяя особое внимание сосудистой сети печени из-за ее значительного участия в дисрегуляции печени, связанной с НАЖБП. Эта методика визуализации позволяет проводить лонгитюдный анализ стеатоза печени и функционального поглощения тканей, а также оценивать относительный объем крови, диаметр воротной вены и плотность сосудистой сети. Понимание адаптации сосудистой сети печени во время прогрессирования НАЖБП и соотнесение этого с другими способами характеристики прогрессирования заболевания (стеатоз, воспаление, фиброз) с использованием предложенного метода может проложить путь к созданию новых, более эффективных и воспроизводимых подходов к исследованию НАЖБП на мышах. Ожидается, что этот протокол также повысит ценность доклинических моделей на животных для исследования разработки новых методов лечения прогрессирования заболевания.

Introduction

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) — это метаболическое заболевание, которое поражает примерно 25% населения и >80% людей с морбидным^{ожирением1}. По оценкам, у одной трети этих людей прогрессирует неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), который характеризуется стеатозом печени, воспалением и фиброзом². НАСГ – стадия заболевания со значительно более высоким риском развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК)^3,4. По этой причине НАСГ в настоящее время является второй наиболее распространенной причиной трансплантации печени, и ожидается, что в скором времени он также станет наиболее важным предиктором трансплантации печени ^5,6,7. Несмотря на распространенность и тяжесть заболевания, для НАЖБП не существует специфической терапии, а существующие методы лечения направлены только на борьбу с ассоциированными с заболеванием патологиями, такими как резистентность к инсулину и гиперлипидемия ^5,6.

В последние годы патофизиологическая роль и адаптации эндотелия и, в целом, сосудистой сети метаболических тканей, таких как жировая ткань и печень, приобретают все большее значение в исследованиях, особенно при ожирении и метаболической дисрегуляции ^7,8. Эндотелий представляет собой клеточный монослой, который выстилает сосудистую сеть изнутри, действуя как функциональный и структурный барьер. Он также способствует различным физиологическим и патологическим процессам, таким как тромбоз, транспорт метаболитов, воспаление и ангиогенез ^9,10. В случае печени сосудистая сеть, среди прочих особенностей, характеризуется наличием высокоспециализированных клеток, определяемых как синусоидальные эндотелиальные клетки печени (ЛСЕК). Эти клетки не имеют базальной мембраны и имеют несколько фенестр, что облегчает перенос субстратов между кровью и паренхимой печени. Благодаря своему уникальному анатомическому расположению и характеристикам, LSEC, вероятно, играют решающую роль в патофизиологических процессах печени, включая развитие воспаления и фиброза печени во время НАЖБП/НАСГ. Действительно, патологические, молекулярные и клеточные адаптации, которые ЛСЕК претерпевают в ходе НАЖБП, способствуют прогрессированию^{заболевания11}. В частности, LSEC-зависимый печеночный ангиогенез, происходящий во время НАЖБП, в значительной степени связан с развитием воспаления и прогрессированием заболевания до НАСГ или даже ГЦК¹². Кроме того, ранняя НАЖБП, связанная с ожирением, характеризуется развитием инсулинорезистентности в ЛЖБП, что предшествует развитию воспаления печени или других распространенных признаков НАЖБП¹³.

Кроме того, в последнее время LSEC стали центральными регуляторами печеночного кровотока и адаптации сосудистой сети при заболеваниях печени различной этиологии^14,15. Действительно, хроническое заболевание печени характеризуется выраженной внутрипеченочной вазоконстрикцией и повышенным сопротивлением кровотоку, что способствует развитию портальной гипертензии¹⁶. В случае с НАЖБП этому явлению способствуют несколько механизмов, связанных с LSEC. Например, инсулинорезистентность, специфичная для LSEC, как упоминалось выше, связана со снижением инсулинозависимой вазодилатации сосудистой сети печени¹³. Кроме того, в течение заболевания сосудистая сеть печени становится более чувствительной к сосудосуживающим средствам, что в дальнейшем способствует нарушению печеночного кровотока и приводит к возникновению сдвигового напряжения, что приводит к нарушению синусоидальной микроциркуляции¹⁷. Эти факты свидетельствуют о том, что сосудистая сеть является ключевой мишенью при заболеваниях печени. Тем не менее, ограничивающими факторами, препятствующими своевременной диагностике и мониторингу НАЖБП/НАСГ, а также разработке потенциальных методов лечения, являются недостатки в последовательной характеристике микроокружения печени и (микро)сосудистой структуры, а также в оценке стадии заболевания пространственно-временным и неинвазивным способом.

Микрокомпьютерная томография (КТ) в настоящее время является золотым стандартом неинвазивного метода визуализации для точного отображения анатомической информации в живом организме. Микро-КТ и МРТ представляют собой два взаимодополняющих метода визуализации, которые могут охватить широкий спектр патологий и обеспечить исключительное разрешение и детализацию визуализируемых структур и тканей. Микро-КТ, в частности, является очень быстрым и точным инструментом, который часто используется для изучения таких патологий, как заболевания костей и связанные с ними изменения костной поверхности¹⁸, оценки прогрессирования фиброза легких с течением времени¹⁹, диагностики рака легких и его стадии²⁰ или даже исследования стоматологических патологий²¹ без какой-либо специальной подготовки (или разрушения) визуализируемых образцов.

Технология визуализации микро-КТ основана на различных свойствах затухания различных органов с точки зрения взаимодействия рентгеновских лучей с веществом. Органы с высокими различиями в ослаблении рентгеновского излучения изображаются на КТ-изображениях с высокой контрастностью (т.е. легкие кажутся темными, а кости светлыми). Органы, обладающие очень похожими свойствами ослабления (разные мягкие ткани), трудно различимы на КТ-изображениях²². Чтобы устранить это ограничение, специализированные контрастные вещества на основе йода, золота и висмута были широко исследованы для использования in vivo . Эти агенты изменяют свойства ослабления тканей, в которых они накапливаются, медленно выводятся из кровообращения и обеспечивают равномерное и стабильное помутнение всей сосудистой системы или выбранных тканей²³.

В диагностике человека для определения содержания жира в печени уже используются компьютерная томография и аналогичные методы, такие как МРТ-измерение протонной плотности жировой фракции^24,25. В контексте НАЖБП высокий контраст мягких тканей необходим для точного различения патологических поражений или мелких сосудов. Для этого используются контрастные вещества, обеспечивающие повышенное контрастирование характеристик печеночной ткани. Такие инструменты и материалы позволяют изучать множественные характеристики печени и возможные проявления патологии, такие как архитектура и плотность сосудистой сети, отложение липидов/стеатоз и функциональный захват тканей/перенос липидов (хиломикрон) в печени. Кроме того, можно оценить относительный объем крови в печени и диаметр воротной вены. За очень короткое время сканирования все эти параметры предоставляют различную и дополняющую информацию об оценке и прогрессировании НАЖБП, которая может быть использована для разработки неинвазивной и детальной диагностики.

В данной статье мы приводим пошаговый протокол использования новых методов микро-КТ визуализации in vivo в качестве неинвазивного метода оценки стадий прогрессирования НАЖБП. Используя этот протокол, можно провести продольный анализ стеатоза печени и функционального поглощения тканей, а также оценить относительный объем крови, диаметр воротной вены и плотность сосудистой сети, которые могут быть применены на мышиных моделях заболеваний печени.

Protocol

Все процедуры были проведены персоналом BIOEMTECH в соответствии с европейскими и национальными нормами благосостояния и были одобрены национальными органами (номер лицензии EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Все эксперименты были спланированы и представлены в соответствии с руководящими принципами П…

Representative Results

В этом репрезентативном исследовании микро-КТ без какого-либо контрастного вещества показала более высокий процент жира в печени у мышей с НАЖБП по сравнению с контрольной группой (табл. 2), что подтверждает патологию. С помощью контрастного вещества ExiTron и описанного выше анал…

Discussion

В настоящее время рекомендуемым методом диагностики и определения стадии НАЖБП у людей является биопсия печени, которая таит в себе риск осложнений кровотечения, а также неточностей отбора проб⁴⁰. Напротив, на животных моделях такой диагноз ставится путем гистологическог?…

Materials

eXIA160	Binitio Biomedical, Inc.		https://www.binitio.com/?Page=Products
High fat diet with 60% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12492
High-fructose corn syrup	Best flavors, CA	hfcs-1gallon
Lacrinorm ophthalmic ointment	Bausch & Lomb
Normal diet with 10% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12450
Viscover ExiTron nano 12000	Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-698
VivoQuant	Invicro
X-CUBE	Molecubes, Belgium		https://www.molecubes.com/systems/