Summary
De haalbaarheid en effectiviteit van high-throughput scRNA-seq-methoden luiden een eencellig tijdperk in plantenonderzoek in. Hier wordt een robuuste en complete procedure gepresenteerd voor het isoleren van specifieke Arabidopsis thaliana wortelceltypen en de daaropvolgende transcriptoombibliotheekconstructie en -analyse.
Abstract
In meercellige organismen kunnen ontwikkelingsprogrammering en omgevingsreacties zeer uiteenlopend zijn in verschillende celtypen of zelfs binnen cellen, wat bekend staat als cellulaire heterogeniteit. In de afgelopen jaren zijn single-cell en cell-type isolatie in combinatie met next-generation sequencing (NGS) technieken belangrijke hulpmiddelen geworden voor het bestuderen van biologische processen bij single-cell resolutie. Het isoleren van plantencellen is echter relatief moeilijker vanwege de aanwezigheid van plantencelwanden, wat de toepassing van eencellige benaderingen in planten beperkt. Dit protocol beschrijft een robuuste procedure voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)-gebaseerde eencellige en celtype-isolatie met plantencellen, die geschikt is voor downstream multi-omics-analyse en andere studies. Met behulp van Arabidopsis wortel fluorescerende markerlijnen, laten we zien hoe bepaalde celtypen, zoals xyleem-pool pericycle cellen, laterale wortel initiële cellen, laterale wortel cap cellen, cortexcellen en endodermale cellen, worden geïsoleerd. Bovendien is er ook een effectieve downstream transcriptoomanalysemethode met behulp van Smart-seq2 beschikbaar. De celisolatiemethode en transcriptoomanalysetechnieken kunnen worden aangepast aan andere celtypen en plantensoorten en hebben een breed toepassingspotentieel in de plantenwetenschap.
Introduction
Cellen zijn de fundamentele eenheid van alle levende organismen en vervullen structurele en fysiologische functies. Hoewel de cellen in meercellige organismen schijnbare synchroniciteit vertonen, vertonen cellen van verschillende typen en individuele cellen verschillen in hun transcriptomen tijdens ontwikkeling en omgevingsreacties. High-throughput single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) biedt ongekende kracht voor het begrijpen van cellulaire heterogeniteit. Het toepassen van scRNA-seq in de plantenwetenschappen heeft bijgedragen aan het succesvol construeren van een plantencelatlas1, is gebruikt om zeldzame cellulaire taxa in plantenweefsels2 te identificeren, heeft inzicht gegeven in de samenstelling van celtypen in plantenweefsels en is gebruikt om cellulaire identiteit en belangrijke functies te identificeren die worden gebruikt tijdens de ontwikkeling en differentiatie van planten. Daarnaast is het mogelijk om spatiotemporale ontwikkelingstrajecten in plantenweefsels 1,2,3 af te leiden om nieuwe markergenen 4 te ontdekken en de functies van belangrijke transcriptiefactoren5 te bestuderen met behulp van scRNA-seq om het evolutionaire behoud van hetzelfde celtype in verschillende planten te onthullen 3. Abiotische spanningen behoren tot de belangrijkste omgevingsinvloeden op de groei en ontwikkeling van planten. Door de veranderingen in de samenstelling van celtypen in plantenweefsels onder verschillende behandelingsomstandigheden te onderzoeken door middel van single-cell transcriptoomsequencing, kan men ook het abiotische stressresponsmechanismeoplossen 6.
Het potentieel voor het oplossen van transcriptionele heterogeniteit tussen celtypen met behulp van scRNA-sequencing hangt af van de celisolatiemethode en het sequencingplatform. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een veelgebruikte techniek voor het isoleren van een subpopulatie van cellen voor scRNA-seq op basis van lichtverstrooiing en de fluorescentie-eigenschappen van de cellen. De ontwikkeling van fluorescerende markerlijnen door transgene technologie heeft de efficiëntie van celisolatie door FACS7 sterk verbeterd. Het uitvoeren van scRNA-seq met behulp van Smart-seq28 verbetert verder het vermogen om de cellulaire heterogeniteit te ontleden. De Smart-seq2-methode heeft een goede gevoeligheid voor gendetectie en kan genen detecteren, zelfs met een lage transcriptinvoer9. Naast het verzamelen van bulkcellen bieden moderne celsorteerders een sorteerformaat voor één celindex, waardoor transcriptoomanalyse met eencellige resolutie mogelijk is met behulp van Smart-seq210 of andere gemultiplexte RNA-seq-methoden, zoals CEL-seq211. Eencellige of celachtige sortering kan mogelijk worden gebruikt voor vele andere downstream-toepassingen, zoals parallelle multi-omics-studies12,13. Hier wordt een robuust en veelzijdig protocol gepresenteerd voor het isoleren van plantenceltypen, zoals xyleempolige pericyclecellen, laterale wortelkapcellen, laterale wortelinitiële cellen, cortexcellen en endodermale cellen uit de wortels van Arabidopsis thaliana markercellijnen door FACS. Het protocol omvat verder het bouwen van de Smart-seq2-bibliotheek voor downstream transcriptoomanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor A. thaliana wild-type (WT) zaden zonder fluorescentie en fluorescerende markerlijnen voor de volgende wortelceltypen: xyleempolige pericyclecellen (J0121), laterale wortelinitiële cellen, laterale wortelkapcellen (J3411), endodermis- en cortexcellen (J0571) (figuur 1A). Alle markerlijnen werden verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen), behalve de laterale wortelinitiatiecelmarkeringslijn, die werd gegenereerd door de introductie van een GATA23-promotorgestuurde GFP-constructie in een wild-type Arabidopsis-plant na een eerder gepubliceerd rapport14.
1. Bereiding van het plantmateriaal
- Steriliseer de A. thaliana WT-zaden en fluorescerende markerlijnzaden door de zaden gedurende 15 minuten in 20% bleekmiddel in een roterende incubator bij kamertemperatuur te incuberen.
- Spoel de zaden drie tot vijf keer af in dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Voer deze stap uit op een steriele schone bank.
- Plak de WT en reporter lijn zaden op halve sterkte Murashige en Skoog (MS) medium met 0,8% agar (w/v)15. Laat de planten verticaal groeien gedurende 5 dagen (16 uur licht bij 23 °C) na 2 dagen stratificeren bij 4 °C.
2. Protoplasting
- Bereid de protoplastoplossingen2,5, aangeduid als oplossing A en oplossing B (zie materiaaltabel).
- Bereid oplossing A met 400 mM mannitol, 0,05% BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2 en 20 mM KCl (zie materiaaltabel). Bewaar oplossing A bij −20 °C gedurende maximaal 1 maand.
- Bereid oplossing B door toevoeging van 1% (w/v) cellulase R10, 1% (w/v) cellulase RS, 1% (w/v) hemicellulase, 0,5% (w/v) pectolyase en 1% (w/v) macerozym R10 in een vers aliquot van oplossing A. Bewaar oplossing B bij −20 °C gedurende maximaal 1 maand.
- Ontdooi oplossing A en oplossing B voorzichtig op ijs voordat u aan het experiment begint.
- Knip de wortels af met een schoon mes of schaar en hak de wortels in stukjes van ~ 0,5 cm. Dompel de wortels onder in 1,5 ml oplossing B, gevolgd door een zachte rotatie (bij ongeveer 18 tpm) bij kamertemperatuur gedurende 1,5-2 uur.
- Filter de wortelprotoplasten door het zeefgaas van 40 μm (zie materiaaltabel).
- Spoel het zeefgaas af met 1-2 ml oplossing A.
- Combineer de vloeistoffen van stap 2.4 en stap 2.5 en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C op 300 x g . Gooi het supernatant weg met een pipet, resuspensie van de celkorrel in 500-600 μL oplossing A en plaats deze onmiddellijk op ijs.
- Breng de geresuspendeerde celoplossing over in een nieuwe reageerbuis van 5 ml voor celsortering.
3. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)
- Schakel de stappen voor het instellen van het instrument op de sorteerder in en voltooi deze (zie Materiaaltabel). Selecteer de fluorescentiekanalen, gebruik een WT-installatie (geen fluorescentie) als controle om de basislijn voor autofluorescentie te bepalen en pas de sorteerpoort aan op basis van de fluorescentie-intensiteit en FSC / SSC-singlets (figuur 2).
- Voeg 500 μL oplossing A (stap 2.1.1) toe aan een opvangbuis van 1,5 ml om te voorkomen dat de cellen worden beschadigd. Verzamel 2.000-3.000 cellen per buis.
- Plaats de monsters na het sorteren onmiddellijk op ijs, centrifugeer de opvangbuis met de cellen gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 300 x g en verwijder het supernatant met een pipet.
- Neem 2 μL gesorteerde cellen en controleer op fluorescentie met behulp van een fluorescentiemicroscoop (zie tabel met materialen).
- Bewaar de gesorteerde cellen bij −80 °C, of gebruik ze onmiddellijk voor het samenstellen van de bibliotheek (stap 4).
- Voor het sorteren van eencellige indexen plaatst u de 96-putplaat in de adapter. Kalibreer de positie van de plaat zodat de druppel in het middelste gat van de plaat valt. Selecteer de sorteermodus met één cel bij het sorteren, voer het doelaantal gesorteerde cellen in als 1 en begin met sorteren.
4. Smart-seq2 bibliotheek voorbereiding
- Als gevolg van de ultralage hoeveelheid invoer, voert u de constructie van een RNA-seq-bibliotheek van het type één cel uit in een contaminatievrije omgeving. Voordat u met het experiment begint, reinigt u de bank met een oppervlakteverontreiniging8 (zie materiaaltabel) en 75% ethanol.
- Bereid lysisbuffer (mengsel A) (tabel 1) voor door 0,33 μl 10% Triton X-100, 0,55 μl RNaseremmer en 0,22 μl 0,1 M DTT te combineren (zie materiaaltabel).
- Voeg 1 μL mengsel A toe aan het gesorteerde monster en maal met een steriele stamper. Het bij voorkeur gewenste monstervolume is ≤0,5 μl; gebruik RNase-vrij water om het volume aan te vullen tot 14 μL. Breng elk afzonderlijk celmonster over in een dunwandige PCR-buis van 0,2 ml.
- Bereid mengsel B met 0,44 μl oligo-dT 30 VN reverse transcriptie (RT) reactieprimer (100 μM) en 4,4 μl dNTP's (10mM) (tabel 2) (zie materiaaltabel).
- Voeg 4,4 μl mengsel B toe aan de 14 μl monster in elke buis, pipetteer voorzichtig om het monster te mengen en incubeer het monster gedurende 3 minuten bij 72 °C. Na incubatie worden de monsters onmiddellijk op ijs gezet om de oligo-dT te hybridiseren naar de poly A-staart.
- Bereid het omgekeerde transcriptiereactiemengsel (mengsel C) (tabel 3) (zie materiaaltabel). Voeg 21,6 μl mengsel C toe aan elke buis die de monsters bevat. Schakel het RT-programma in op een gemeenschappelijk PCR-instrument (tabel 4).
- Voer de voorversterkingsreactie uit op ijs. Bereid mengsel D door 44 μL 2x PCR-polymerasemengsel en 0,88 μL IS PCR-primer (10 μM) (tabel 5) te combineren (zie materiaaltabel). Voeg 40,8 μl mengsel D toe aan de 40 μl RT-reactieproduct en voer het voorversterkerprogramma uit (tabel 6).
- Zuiver de voorversterkingsreactieproducten met Ampure XP-kralen (zie materiaaltabel). Voeg 48 μL kralen (0,6:1 verhouding) toe aan elk monster uit stap 4.7 en meng de monsters voorzichtig door te pipetteren.
- Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Plaats de buisjes van 1,5 ml met de monsters gedurende 5 minuten op een magnetische scheidingsstandaard. Gooi het supernatant voorzichtig uit de monsters weg zonder de kralen te verstoren.
- Was de kralen door ze opnieuw te gebruiken in 200 μL 80% ethanol en plaats de monsters nog eens 3 minuten op de magnetische scheidingsstandaard (zie materiaaltabel) voordat u het ethanolhoudende supernatant weggooit.
- Droog de monsters gedurende 10 minuten aan de lucht en bedek de buis om verontreiniging en kruisbesmetting tijdens het drogen aan de lucht te voorkomen.
- Resuspendeer de kralen in 20 μL ddH2O, incuber de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en plaats ze vervolgens gedurende 5 minuten op de magnetische scheidingsstandaard.
- Pipetteer 18 μL van het supernatant uit elke buis en breng de monsters over in nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml. Gebruik 1 μL van het monster om de kwaliteit van het cDNA te beoordelen met behulp van een DNA-kwantificeringskit, bepaal de grootteverdeling van elke prebibliotheek met behulp van een fragmentanalysator (zie materiaaltabel) en bewaar het resterende monster bij −20 °C.
- Bouw een cDNA-bibliotheek8 voor Illumina-sequencing 16 uit het prebibliotheekproduct van stap4.13 met behulp van een voorbereidingskit voor sequencingbibliotheken (zie Materiaaltabel).
- Zuiver de bibliotheken (vanaf stap 4.14) met behulp van de Ampure XP-kralen, kwantificeer de gezuiverde bibliotheken en bepaal de grootteverdeling van elke bibliotheek volgens stap 4.13.
OPMERKING: Pool gelijke nanomol van elke bibliotheek en zorg ervoor dat geen van hen dezelfde combinatie van Illumina-index heeft. Anders kunnen de bibliotheken worden samengevoegd in een verhouding op basis van de gewenste sequencing-uitvoer en samen worden gesequenced op dezelfde baan van de Illumina-sequencer. Over het algemeen biedt het sequentiëren van elke bibliotheek tot een diepte van 4-6 GB, wat > 10 miljoen in kaart gebrachte lezingen oplevert, 20x-30x dekking van het Arabidopsis-genoom . Lagere sequencingdiepten zijn ook acceptabel, maar kunnen van invloed zijn op de betekenis van de differentiaalexpressieanalyse.
5. RNA-seq data-analyse
- Trim de onbewerkte reads met Trim-Galore17 gevolgd door mapping naar het referentiegenoom met behulp van hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2), en verwijder de PCR gedupliceerde fragmenten met Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
- Voer de ruwe tellingsverwerking en daaropvolgende analyse van de differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG) uit met DESeq220 met behulp van ten minste drie biologische replicaties voor elk monster. Voer clustering van de genexpressie uit met het Pheatmap-pakket en visualiseer in een expressie-heatmap.
OPMERKING: De RPKM-waarden (reads per kilobase per million mapped reads) van de genen en de TSE's (transponeerbare elementen) werden berekend met Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) en gevisualiseerd in een genoombrowser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protoplast isolatie
Dit protocol is effectief voor de protoplastsortering van fluorescerende A. thaliana wortelmarkeringslijnen. Deze markerlijnen zijn ontwikkeld door de fusie van fluorescerende eiwitten met genen die specifiek tot expressie komen in doelceltypen, of met behulp van enhancer trap-lijnen (figuur 1). Talrijke weefsels en organen zijn ontleed in celtypen die specifieke fluorescerende markers in modelplanten en gewassen tot expressie brengen.
FACS-populatie, gesorteerde cellen en bibliotheek-QC
Door een wild-type plant te gebruiken als controle en poorten in te stellen zoals forward scatter (FSC) en side scatter (SSC), bepaalden we een belangrijke populatie van cellen van belang en een basislijn voor autofluorescentie en sorteerden we met succes de fluorescentie-specifieke gemarkeerde cellen (figuur 2). De kwaliteit van de uiteindelijke sequencingbibliotheken (vanaf stap 4.15) werd bepaald door de fragmentgrootteverdelingsanalyse. De representatieve resultaten van de RNA-seq-bibliotheek van ongeveer 2.000 xyleempolige pericyclecellen, laterale wortelprimordiacellen, endodermis / cortexcellen en laterale wortelkapcellen worden weergegeven in figuur 3A-D.
Analyse van expressiepatronen
De kwaliteit van de sequencinggegevens kan worden geëvalueerd aan de hand van meerdere analyseprocedures, zoals sequencingdiepte, mappingsnelheid en fastQC-rapporten. De nauwkeurigheid en gevoeligheid van de sequencinggegevens kan worden aangetoond door de aanwezigheid van een reeks met celtype verrijkte genen, die kunnen worden geïdentificeerd uit de DEG-analyse tussen geïsoleerde celtypen en het hele weefsel. Genen met significant hogere expressieniveaus in bepaalde celtypen kunnen worden geïdentificeerd als celtype verrijkte genen. Ondertussen kunnen de genoom-browserweergaven van elk celtype naast elkaar worden vergeleken om de expressieniveaus van bekende markergenen te tonen en te testen of het expressiepatroon van de markergenen kan worden gereconstrueerd in de expressiegegevens van het celtype. Als voorbeeld werden de genen die verrijkt zijn in een van de vier wortelceltypen geclusterd en weergegeven in heatmap, die de specificiteit van genexpressie tussen verschillende celtypen liet zien (figuur 4). YUCCA3, MYB36, WOX5 en PFA1 werden onderzocht en de expressiepatronen waren zoals verwacht volgens eerdere rapporten21,22,23,24. Data-analysepijplijnen en representatieve ruwe sequencinggegevens zijn beschikbaar in een openbare opslagplaats (github.com/gaolabsjtu/root_cell_types_RNAseq).
Figuur 1: De specifieke celtypemarkeringslijn van wortel- en protoplastpreparaat . (A, links) Inleiding en afbeeldingen van de overvullinglijn van Enhancer. (A, rechts) De specifieke celtypemarkeringslijn van de wortel. (B) Een afbeelding van het protoplastpreparaat vóór het sorteren. De schaalstaven voor de laterale wortelstichtercel, pericyclus, endodermis / cortex, laterale wortelkap en protoplasten vertegenwoordigen respectievelijk 25 μm, 100 μm, 100 μm, 75 μm en 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vaststelling van FACS voor specifieke wortelceltypen. Voorbeeld van een FACS-experiment: (A) de belangrijkste populatie die SSC en FSC gebruikt; B) de GFP-positieve (+) en GFP-negatieve (−) poorten; (C) de brightfield en (D) fluorescentiebeelden van de gesorteerde cellen. De schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Grootteverdeling van Smart-seq2-sequencingbibliotheken. Representatieve fragmentgrootteverdelingen van de sequencingbibliotheken (vanaf stap 4.15) gegenereerd uit xyleempolige pericyclecellen (A), laterale wortelprimordiacellen (B), endodermis/cortexcellen (C) en laterale wortelkapcellen (D). (E) Een kleine bibliotheek met primer/adapter dimeerpieken, die na de grootteselectie nog steeds kunnen worden gesequenced. (F) Een bibliotheek met een abnormale grootteverdeling, wat duidt op een mislukte bibliotheekvoorbereiding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Celtype-verrijkte genanalyse. Er werd een DEG-analyse uitgevoerd tussen elk celtype en de hele wortel; Genen met meer dan viervoudige upregulatie in elk celtype werden geïdentificeerd als celtype-verrijkte genen. Deze genen werden gecombineerd, geclusterd en gevisualiseerd in de heatmap (bovenste paneel) plot. De celtype-verrijkte genen omvatten veel bekende markergenen; typische markergenen zoals YUCCA3, MYB36, WOX5 en PFA1 werden gekozen om te tonen in de genoombrowser (onderste paneel). Afkortingen: LRP = laterale wortel primordia; Endo/Cor = endodermis/cortex; LRC = laterale wortelkap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Onderdelen | Volume (μL) |
| 10% Triton X-100 | 0.33 |
| RNaseremmer | 0.55 |
| DTT (0,1 m) | 0.22 |
Tabel 1: Reactiecomponenten voor de bereiding van de cellysebuffer (mengsel A).
| Onderdelen | Volume (μL) |
| Oligo-dT30VN (100 μM) | 0.44 |
| dNTP's (10 mM) | 4.4 |
Tabel 2: Reactiecomponenten voor de bereiding van mengsel B.
| Onderdelen | Volume (μL) |
| SuperScript IV buffer (5x) | 8.8 |
| Betaïne (5 m) | 8.8 |
| DTT (0,1 m) | 2.2 |
| MgCl2 (1 m) | 0.264 |
| TSO (100 μM) | 0.44 |
| SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/μL) | 2.2 |
| RNaseremmer | 1.1 |
Tabel 3: Reactiecomponenten voor de bereiding van het PCR-mengsel met omgekeerde transcriptie (mengsel C).
| Cyclus | Temperatuur (°C) | Tijd |
| 1 | 50 | 90 min |
| 2-11 | 55 | 2 min |
| 50 | 2 min | |
| 12 | 70 | 15 min |
| 13 | 4 | ∞ |
Tabel 4: Reverse transcriptie (RT) PCR-instellingen voor het synthetiseren van cDNA uit mRNA.
| Onderdelen | Volume (μL) |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | 44 |
| IS PCR primer (10 μM) | 0.88 |
Tabel 5: Reactiecomponenten voor de bereiding van het voorversterkingsreactiemengsel (mengsel D).
| Cyclus | Temperatuur (°C) | Tijd |
| 1 | 98 | 5 min |
| 2-13 | 98 | 20 s |
| 67 | 30 s | |
| 72 | 3 min | |
| 14 | 72 | 5 min |
| 15 | 4 | ∞ |
Tabel 6: PCR-programma-instellingen voor de voorversterkingsreactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het op Smart-seq2 gebaseerde protocol kan betrouwbare sequencingbibliotheken genereren uit enkele honderden cellen8. De kwaliteit van het uitgangsmateriaal is essentieel voor de nauwkeurigheid van de transcriptoomanalyse. FACS is een krachtig hulpmiddel voor het voorbereiden van cellen van belang, maar deze procedure, met name de protoplastische stap, moet worden geoptimaliseerd voor plantaardige toepassingen. Laser capture microdissection (LCM) of handmatig ontleedde cellen kunnen ook worden gebruikt als input25,26, dus het hier verstrekte protocol kan mogelijk worden gebruikt in een verscheidenheid aan plantensoorten en celtypen met of zonder bekende markergenen.
Bereiding van het plantmateriaal
In de ontwikkelingsbiologie van planten wordt FACS meestal gebruikt om verrijkte celpopulaties te isoleren die een fluorescerende marker tot expressie brengen. De planten die zo'n marker tot expressie brengen, zijn protoplastisch en de protoplasten worden uiteindelijk gesorteerd in zuivere subpopulaties op basis van de expressie van de celtypespecifieke marker. Daarom moet het signaal van de fluorescerende marker sterk en specifiek zijn. Daarnaast moet de onderzoeker vooraf nagaan welke markers gesorteerd kunnen worden. Het aantal benodigde zaden hangt af van het expressieniveau, waar de marker wordt uitgedrukt, hoeveel cellen nodig zijn voor downstream-toepassingen en hoeveel replicaties worden gesorteerd. Als de expressie zich in een enkel celtype bevindt met zeer weinig cellen per plant, is over het algemeen een groter aantal planten nodig dan wanneer de marker wordt uitgedrukt in een hoger aantal cellen. Het is het beste om empirisch het aantal zaden te bepalen dat nodig is voor individuele markerlijnen. Het is vooral zinvol om voorbereidende experimenten uit te voeren met elke markeringslijn om het venster voor sortering te optimaliseren en te weten hoeveel cellen het resultaat zullen zijn van een vast aantal planten. Als het experimentele materiaal wortels zijn, om te voorkomen dat de wortels in de agar zakken en om het snijden van schone wortels te vergemakkelijken, kan een passend formaat en geautoclaveerd gaas op de mediumbevattende agar worden gelegd voordat het zaad wordt platgelegd. Stratificatie bij lage temperatuur helpt de kieming en ontwikkeling van zaden, dus we raden aan om de zaden gedurende 2 dagen na sterilisatie of plating bij 4 °C te stratificeren en vervolgens de planten verticaal te laten groeien.
Protoplasting en FACS
Protoplasting en sortering 5-6 dagen na stratificatie werken goed. Oplossing A en oplossing B moeten worden gefilterd met een zeef van 0,22 μm. Bovendien vermindert het bewaren van oplossing B bij −20 °C over langere tijdsperioden de efficiëntie van de enzymen. Voordat u begint, moeten oplossing A en oplossing B voorzichtig worden ontdooid op ijs, wat ongeveer 20 minuten duurt. Oplossing B mag niet worden geschud, omdat het schudden van oplossing B de enzymen kan verstoren en overmatige bubbelvorming kan veroorzaken. Het meerdere keren wassen van het zeefgaas met oplossing A kan het aantal cellen dat in stap 2.5 wordt verkregen, verhogen. Zoals beschreven in stap 2.6, mag het gehele supernatant niet worden aangezogen, omdat de protoplasten zich onderaan in de buurt van de pellet bevinden en niet kunnen worden gezien. Voor het sorteren is het het beste om ervoor te zorgen dat de concentratie van protoplasten ongeveer 10 5-106 cellen / ml is om een betere sorteerefficiëntie te bereiken. Bij het opzetten van een nieuw experiment is hetzelfde weefsel van de WT-installatie nodig als controle voor het instellen van de sorteerpoort. In stap 3.1 wordt aanbevolen om eerst de fluorescentiekanalen (bijv. PE en FITC) te selecteren en een controlemonster te gebruiken om de belangrijkste populatie te bepalen op basis van SSC en FSC. Bovendien wordt voorgesteld om de positie van de poort aan te passen door de spanning van het fluorescentiekanaal te wijzigen om ervoor te zorgen dat het besturingssignaal zich links van de poort bevindt (d.w.z. de negatieve groep bevindt zich onder 103). De sorteertijd moet worden beperkt tot 30 minuten of minder dan 60 minuten om veranderingen in de genexpressie te voorkomen, die kunnen optreden als gevolg van protoplasting of sortering. Na het sorteren moet een klein aantal gesorteerde cellen worden verzameld en gecontroleerd op fluorescentie (stap 3.4). Er moet zoveel mogelijk buffer uit het supernatant worden verwijderd om gevolgen voor de stroomafwaartse bibliotheekconstructie te voorkomen (stap 3.3).
Bouw van de RNA-seq bibliotheek
Voor de bouw van de RNA-seq-bibliotheek raden we aan om cellen onmiddellijk na het sorteren te gebruiken om de afbraak van het RNA te verminderen. Het is niet aan te raden om met te veel cellen te beginnen, omdat dit kan resulteren in een bibliotheek van slechte kwaliteit als gevolg van ontoereikende reacties. Het aantal PCR-cycli in stap 4.7 en stap 4.14 is afhankelijk van de invoerhoeveelheid RNA/cDNA. Het aantal cycli kan worden verhoogd wanneer er minder invoer is of worden verlaagd wanneer er meer invoer is. Daarom wordt aanbevolen om enkele van de gemengde monsters uit stap 4.7 en stap 4.14 te nemen om de real-time PCR met dezelfde versterkingsprocedure uit te voeren en vervolgens het uiteindelijke aantal cycli te bepalen op basis van de resultaten van de qPCR vóór de formele versterking van de prebibliotheek / bibliotheek. Bovendien moeten de Ampure XP-kralen vóór de zuiveringsstap 4.8 gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur in evenwicht worden gebracht en vervolgens goed worden gevortexeerd. Het volume van de kralen in de zuiveringsstap mag niet worden verhoogd tot boven de verhouding 0,8: 1. Anders zal dit de overdracht van primerdimeren vergroten. Bovendien moet men voorkomen dat de kralen in stap 4.11 te veel drogen om moeilijke resuspensie te voorkomen. Een gekwalificeerde pre-bibliotheek moet een gemiddelde grootte hebben van ongeveer 1,5-2 kb en een kleine hoeveelheid korte (<500 bp) fragmenten. Abnormale grootteverdelingen of kleine primer/adapter dimeerpieken in bibliotheken zijn indicatoren van slechte kwaliteit, en deze monsters moeten worden weggegooid of verdere rondes van kralenzuivering ondergaan (stap 4.15) (figuur 3E-F).
Beperkingen
Dit protocol kan worden toegepast om cellen te isoleren van andere plantenweefsels en andere plantensoorten. Het celisolatieproces is echter sterk afhankelijk van de bereiding van de protoplasten. Sommige celtypen zijn moeilijk te isoleren, zoals vaatcellen en vrouwelijke geslachtscellen, die zich in het binnenste van het weefsel bevinden en/of weinig in aantal zijn. Voor cellen waarvoor het moeilijk is om protoplasten te bereiden, is fluorescentie-geactiveerde kernsortering (FANS)27 een optionele methode die kan worden gebruikt. Ondertussen is het gebruik van dit protocol om specifieke celtypen door FACS te verkrijgen afhankelijk van de beschikbaarheid van fluorescerende markerlijnen. Het ontbreken van dergelijke markeringslijnen beperkt het gebruik van deze methoden in gewassen en tuinbouwplanten. De toepassing van high-throughput single-cell RNA-seq-technologie in gewassen zal nieuwe celtype-specifieke markergenen onthullen, die verder kunnen worden gebruikt om celtypemarkerlijnen te ontwikkelen en de toepassingscapaciteit van FACS-gebaseerde celtype RNA-seq en multi-omics-studies te verbreden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We hebben dit protocol opgezet in de eencellige multi-omics-faciliteit van de School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, en werden ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), het Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) en Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript IV buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| Test tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
- Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M.
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
