Enrichissement des vésicules extracellulaires natives et recombinantes de mycobactéries

Summary

Ce protocole détaille l’enrichissement des vésicules extracellulaires mycobactériennes natives (mEVs) à partir de cultures axéniques de Mycobacterium smegmatis (Msm) et comment les MsmEVs recombinants contenant mCherry (un rapporteur fluorescent rouge) peuvent être conçus et enrichis. Enfin, il vérifie la nouvelle approche avec l’enrichissement de MsmEVs contenant la protéine EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

La plupart des bactéries, y compris les mycobactéries, génèrent des vésicules extracellulaires (VE). Étant donné que les VE bactériennes (bEV) contiennent un sous-ensemble de composants cellulaires, notamment des métabolites, des lipides, des protéines et des acides nucléiques, plusieurs groupes ont évalué les versions natives ou recombinantes des bEV pour leur pouvoir protecteur en tant que candidats vaccins sous-unitaires. Contrairement aux VE natifs, les VE recombinants sont génétiquement modifiés pour contenir un ou plusieurs immunogènes d’intérêt. Au cours de la dernière décennie, différents groupes ont exploré diverses approches pour générer des bEV recombinants. Cependant, nous rapportons ici la conception, la construction et l’enrichissement des VE mycobactériennes recombinantes (mEV) dans les mycobactéries. Pour ce faire, nous utilisons Mycobacterium smegmatis (Msm), une mycobactérie avirulente du sol comme système modèle. Nous décrivons d’abord la génération et l’enrichissement des EV natifs de Msm. Ensuite, nous décrivons la conception et la construction de mEVs recombinants qui contiennent soit mCherry, une protéine rapporteure fluorescente rouge, soit EsxA (Esat-6), un immunogène important de Mycobacterium tuberculosis. Nous y parvenons en fusionnant séparément les N-terminaisons mCherry et EsxA avec l’extrémité C d’une petite protéine Msm, Cfp-29. Cfp-29 est l’une des rares protéines abondamment présentes chez les MsmEVs. Le protocole de génération et d’enrichissement des mEVs recombinants à partir de Msm reste identique à celui de génération et d’enrichissement des EVs natifs de Msm.

Introduction

Malgré le développement et l’administration d’une large gamme de vaccins contre les maladies infectieuses, encore aujourd’hui, ~30 % de tous les décès humains sont dus à des maladies transmissibles¹. Avant l’avènement du vaccin antituberculeux (TB) – Bacillus Calmette Guérin (BCG) – la tuberculose était la première cause de mortalité (~10 000 à 15 000/100 000 habitants)². Grâce à l’administration du BCG et à l’accès facile aux médicaments antituberculeux de première et de deuxième intention, en 2022, le nombre de décès liés à la tuberculose a considérablement chuté à ~1 million/an en 2022 (c’est-à-dire ~15-20/100 000 habitants¹). Cependant, dans les populations endémiques de tuberculose dans le monde, les décès liés à la tuberculose continuent de se situer entre ~100 et 550/100 000 habitants¹. Bien que les experts reconnaissent plusieurs raisons conduisant à ces chiffres faussés, la protection médiée par le BCG ne dure même pas pendant la première décennie de la vie semble être la principale raison 3,4,5,6,7. Par conséquent, compte tenu des « Objectifs de développement durable » renouvelés de l’ONU et de la « Stratégie pour mettre fin à la tuberculose » de l’OMS, il y a un effort mondial concerté pour développer une alternative vaccinale bien supérieure au BCG qui offre peut-être une protection à vie contre la tuberculose.

Pour atteindre cet objectif, plusieurs groupes évaluent actuellement des souches modifiées/recombinantes du BCG, des espèces mycobactériennes non pathogènes et atténuées autres que le BCG, et des sous-unités candidates 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . En règle générale, les vaccins sous-unitaires sont des liposomes chargés sélectivement avec peu de protéines immunogènes purifiées (~1-6) de longueur complète ou tronquée de l’agent pathogène. Cependant, en raison de leur repliement parasite en conformations non natives et/ou d’interactions aléatoires non fonctionnelles entre les protéines chargées, les sous-unités manquent souvent d’épitopes natifs et germaniques et, par conséquent, ne parviennent pas à amorcer suffisamment le système immunitaire^14,19,20.

Par conséquent, les vésicules extracellulaires (VE) des bactéries ont pris de l’ampleur en tant qu’alternative prometteuse 21,22,23,24,25,26. En règle générale, les VE bactériennes (bEV) contiennent un sous-ensemble de leurs composants cellulaires, y compris certaines portions d’acides nucléiques, de lipides et des centaines de métabolites et de protéines^27,28. Contrairement aux liposomes où quelques protéines purifiées sont chargées artificiellement, les bEV contiennent des centaines de protéines naturellement chargées, repliées nativement, avec une meilleure propension à amorcer le système immunitaire, en particulier sans le coup de pouce / l’aide d’adjuvants et d’agonistes des récepteurs de type Toll (TLR)^27,28,29. C’est dans cette ligne de recherche que nous et d’autres avons exploré l’utilité des VE mycobactériennes en tant que boosters potentiels de sous-unités du BCG³⁰. Malgré les inquiétudes selon lesquelles les bEV n’ont pas de charges antigéniques uniformes, les VE de Neisseria meningitidis atténué ont réussi à protéger les humains contre le méningocoque du sérogroupe^{B 31,32}.

Du moins en théorie, les meilleurs VE qui pourraient bien booster le BCG sont les VE enrichis en bactéries pathogènes. Cependant, l’enrichissement des VE générées par des mycobactéries pathogènes est coûteux, long et risqué. De plus, les VE générées par des agents pathogènes peuvent être plus virulentes que protectrices. Compte tenu des risques potentiels, nous rapportons ici un protocole bien testé pour l’enrichissement des VE générées par le Msm cultivé axéniquement, une mycobactérie avirulente.

Cependant, bien qu’elles codent pour plusieurs orthologues de protéines pathogènes, les mycobactéries avirulentes manquent de plusieurs antigènes vaccinaux/épitopes protéiques pathogènes nécessaires pour préparer suffisamment le système immunitaire à la protection³³. Par conséquent, nous avons également exploré la construction et l’enrichissement des VE recombinantes de Msm par ingénierie moléculaire, de sorte qu’une partie importante de toute protéine pathogène d’intérêt exprimée et traduite en Msm, doit atteindre ses EV. Nous avons émis l’hypothèse qu’une ou plusieurs des 10 protéines les plus abondantes des VE Msm, lorsqu’elles sont fusionnées à la protéine d’intérêt, aideront à une telle translocation.

Alors que nous commencions à standardiser l’enrichissement des VE mycobactériennes (mEVs) dans notre laboratoire, en 2011, Prados-Rosales et al. ont rapporté pour la première fois la visualisation et l’enrichissement des mEVs in vitro³⁰. Plus tard, en 2014, le même groupe a publié une version modifiée de sa méthode³⁴ de 2011. En 2015, Lee et al. ont également fait état d’une méthode standardisée indépendante pour l’enrichissement en mEV à partir de cultures axéniques de mycobactéries³⁵. En combinant les deux protocoles^34,35 et en incorporant quelques-unes de nos modifications après une standardisation approfondie^, nous décrivons ici un protocole qui permet d’enrichir régulièrement les mEVs à partir de cultures axéniques de mycobactéries ³⁶.

Ici, nous détaillons particulièrement l’enrichissement des VE spécifiques au MSM, qui est une extension d’un protocole publié³⁶ pour l’enrichissement des VE mycobactériennes en général. Nous détaillons également comment construire des mEVs recombinants (R-mEVs) qui contiennent la protéine mCherry (en tant que rapporteur fluorescent rouge) et EsxA (Esat-6)^37,38,39, un immunogène prédominant et une sous-unité potentielle de vaccinogène de Mycobacterium tuberculosis. Le protocole d’enrichissement des R-mEVs reste identique à celui que nous avons décrit pour l’enrichissement des VE natifs à partir de Msm.

Protocol

1. Conditions de croissance de Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli et de leurs dérivés MédiaBouillon liquide Middlebrook 7H9Préparez la solution mère Tween-80 à 20 % en préchauffant le volume requis d’eau doublement distillée (ddw) dans un bécher en verre à ~45-50 °C au micro-ondes, ajoutez le volume requis de Tween-80 à l’aide d’une éprouvette de mesure appropriée et remuez continuellement …

Representative Results

Nous utilisons M. smegmatis (Msm) comme mycobactérie modèle pour démontrer l’enrichissement des mEVs natives et recombinantes (R-mEVs). Ce protocole d’enrichissement des mEVs résumé schématiquement (Figure 1) fonctionne également pour l’enrichissement des R-mEVs de Msm et des EVs natifs de Mtb (avec des modifications mineures comme dans les notes de protocole de 1.2). La visualisation des mEVs enrichis nécessite de les colorer négativement au microscope électronique …

Discussion

Étant donné que la mise au point d’un nouveau vaccin antituberculeux supérieur au BCG et capable de le remplacer reste un défi de taille, plusieurs groupes poursuivent la découverte de différents vaccins antituberculeux sous-unitaires capables d’augmenter la puissance du BCG et de prolonger sa durée de protection^48,49. Compte tenu de l’attention croissante portée aux VE bactériennes (bEV) en tant que sous-unités potentielles et adjuvants naturels<…

Materials

A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155