העשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות ורקומביננטיות של מיקובקטריה

Summary

פרוטוקול זה מפרט את ההעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (mEVs) מקוריות מתרביות אקסניות של Mycobacterium smegmatis (Msm) וכיצד ניתן לתכנן ולהעשיר MsmEV רקומביננטי המכיל mCherry (כתב פלואורסצנטי אדום). לבסוף, הוא מאמת את הגישה החדשנית עם העשרה של MsmEV המכילים את חלבון EsxA של Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

רוב החיידקים, כולל מיקובקטריה, מייצרים בועיות חוץ-תאיות (EV). מאחר שרכבים חשמליים חיידקיים (bEVs) מכילים תת-קבוצה של רכיבים תאיים, כולל מטבוליטים, שומנים, חלבונים וחומצות גרעין, מספר קבוצות העריכו את הגרסאות המקוריות או הרקומביננטיות של bEV על עוצמת ההגנה שלהן כמועמדים לחיסון תת-יחידתי. שלא כמו כלי רכב חשמליים מקומיים, כלי רכב חשמליים רקומביננטיים מהונדסים מולקולרית כך שיכילו אימונוגן אחד או יותר בעלי עניין. במהלך העשור האחרון, קבוצות שונות בחנו גישות מגוונות ליצירת bEV רקומביננטי. עם זאת, כאן אנו מדווחים על תכנון, בנייה והעשרה של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים רקומביננטיים (mEVs) במיקובקטריה. לשם כך, אנו משתמשים ב-Mycobacterium smegmatis (Msm), מיקובקטריום אדמה אלים כמערכת המודל. תחילה נתאר את היצירה וההעשרה של כלי רכב חשמליים מקומיים של Msm. לאחר מכן, אנו מתארים את התכנון והבנייה של mEV רקומביננטי המכיל mCherry, חלבון כתב פלואורסצנטי אדום, או EsxA (Esat-6), אימונוגן בולט של Mycobacterium tuberculosis. אנו משיגים זאת על ידי מיזוג נפרד של mCherry ו- EsxA N-termini עם C-terminus של חלבון Msm קטן Cfp-29. Cfp-29 הוא אחד החלבונים הבודדים שנמצאים בשפע של MsmEVs. הפרוטוקול ליצירה והעשרה של mEV רקומביננטי מ-Msm נותר זהה ליצירה ולהעשרה של כלי רכב חשמליים מקוריים של Msm.

Introduction

למרות הפיתוח והניהול של מגוון רחב של חיסונים נגד מחלות זיהומיות, אפילו עד עצם היום הזה, ~ 30% מכלל מקרי המוות האנושיים עדיין מתרחשים ממחלות מידבקות¹. לפני הופעת החיסון נגד שחפת – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – שחפת הייתה גורם התמותה מספר אחת (~10,000 עד 15,000/100,000 תושבים)². עם מתן BCG וגישה קלה לתרופות קו ראשון ושני נגד שחפת, עד 2022, מקרי מוות הקשורים לשחפת ירדו באופן דרמטי ל~1 מיליון לשנה עד 2022 (כלומר, ~ 15-20/100,000 אוכלוסייה¹). עם זאת, באוכלוסיות אנדמיות לשחפת בעולם, מקרי מוות הקשורים לשחפת ממשיכים לעמוד על ~ 100-550/100,000 אוכלוסייה¹. בעוד מומחים מכירים במספר סיבות שהובילו למספרים מוטים אלה, נראה כי הגנה בתיווך BCG שאינה נמשכת אפילו בעשור הראשון לחיים היא הסיבה הבולטת 3,4,5,6,7. כתוצאה מכך, בהתחשב ב”יעדי פיתוח בר-קיימא” המחודשים של האו”ם וב”אסטרטגיית סוף השחפת” של ארגון הבריאות העולמי, ישנו מאמץ עולמי מרוכז לפתח חלופה חיסונית עדיפה בהרבה ל-BCG, שאולי מספקת הגנה לכל החיים מפני שחפת.

לקראת מטרה זו, מספר קבוצות מעריכות כעת זני BCG מותאמים/רקומביננטיים, זנים מיקובקטריאליים לא פתוגניים ומוחלשים שאינם BCG, ומועמדים לתת-יחידות 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . בדרך כלל, חיסונים תת-יחידות הם ליפוזומים הנטענים באופן סלקטיבי עם מעט חלבונים אימונוגניים מטוהרים (~1-6) באורך מלא או קטועים של הפתוגן. עם זאת, בגלל הקיפול המזויף שלהם לקונפורמציות לא ילידיות ו / או אינטראקציות אקראיות לא פונקציונליות בין החלבונים הטעונים, תת-יחידות חסרות לעתים קרובות אפיטופים מקומיים וגרמניים ולכן אינן מצליחות להכשיר מספיק את מערכת החיסון^14,19,20.

כתוצאה מכך, שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) של חיידקים תפסו תאוצה כחלופה מבטיחה 21,22,23,24,25,26. בדרך כלל, כלי רכב חשמליים חיידקיים (bEVs) מכילים תת-קבוצה של המרכיבים התאיים שלהם, כולל חלקים מסוימים של חומצות גרעין, שומנים ומאות מטבוליטים וחלבונים^27,28. שלא כמו ליפוזומים שבהם כמה חלבונים מטוהרים נטענים באופן מלאכותי, bEV מכילים מאות חלבונים טעונים באופן טבעי, מקופלים באופן טבעי עם נטייה טובה יותר להפעיל את מערכת החיסון, במיוחד ללא דחיפה/סיוע של אדג’ובנטים ואגוניסטים לקולטן דמוי אגרה (TLR)^27,28,29. בקו מחקר זה אנו ואחרים בחנו את התועלת של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים כמאיצי תת-יחידות פוטנציאליים ל-BCG³⁰. למרות החששות כי bEVs חסרים עומסי אנטיגן אחידים, EVs מ Neisseria meningitidis מוחלש הגנו בהצלחה על בני אדם מפני מנינגוקוק serogroup B^31,32.

לפחות תיאורטית, כלי הרכב החשמליים הטובים ביותר שיכולים להגביר היטב את BCG הם כלי הרכב החשמליים המועשרים מחיידקים פתוגניים. עם זאת, העשרת כלי רכב חשמליים הנוצרים על ידי מיקובקטריום פתוגני היא יקרה, גוזלת זמן ומסוכנת. בנוסף, כלי רכב חשמליים שנוצרו על ידי פתוגן עשויים להיות אלימים יותר מאשר מגנים. בהתחשב בסיכונים הפוטנציאליים, כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול בדוק היטב להעשרת כלי רכב חשמליים שנוצר על ידי Msm שגדל באופן אקסני, מיקובקטריום אלים.

עם זאת, למרות קידוד מספר אורתולוגים של חלבונים פתוגניים, מיקובקטריה אלימים חסרים מספר אנטיגנים חיסוניים / אפיטופים של חלבון פתוגני הדרושים כדי להכין מספיק את מערכת החיסון לקראת הגנה³³. לכן, בחנו גם בנייה והעשרה של כלי רכב חשמליים רקומביננטיים של MSM באמצעות הנדסה מולקולרית, כך שחלק משמעותי מכל חלבון פתוגני בעל עניין המובע ומתורגם ב-MSM, חייב להגיע לרכבים החשמליים שלו. שיערנו כי אחד או יותר מ-10 החלבונים הנפוצים ביותר של Msm EVs כאשר הם מאוחים לחלבון המעניין יסייעו בטרנסלוקציה כזו.

בזמן שהתחלנו לתקנן את ההעשרה של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים (mEVs) במעבדה שלנו, בשנת 2011, Prados-Rosales ועמיתיו דיווחו לראשונה על הדמיה והעשרה של mEV במבחנה³⁰. מאוחר יותר, בשנת 2014, אותה קבוצה פרסמה גרסה שונה של שיטת^{2011 34}. בשנת 2015, Lee et al. דיווחו גם על שיטה סטנדרטית עצמאית להעשרת mEV שוב מתרביות אקסניות של מיקובקטריה³⁵. בשילוב שני הפרוטוקולים^34,35 ושילוב כמה מהשינויים שלנו לאחר סטנדרטיזציה יסודית^, אנו מתארים כאן פרוטוקול המסייע להעשיר באופן שגרתי mEV מתרביות אקסניות של מיקובקטריה ³⁶.

כאן אנו מפרטים במיוחד את ההעשרה של כלי רכב חשמליים ספציפיים ל-Msm, שהיא הרחבה של פרוטוקול³⁶ שפורסם להעשרת רכבים חשמליים מיקובקטריאליים בכלל. אנו גם מפרטים כיצד לבנות mEV רקומביננטי (R-mEVs) המכילים את חלבון mCherry (ככתב פלואורסצנטי אדום) ואת EsxA (Esat-6)^37,38,39, אימונוגן דומיננטי ותת-יחידה פוטנציאלית מחוסנת של Mycobacterium tuberculosis. הפרוטוקול להעשרת ה-R-mEV נותר זהה לזה שתיארנו להעשרת כלי רכב חשמליים מקומיים מ-Msm.

Protocol

1. תנאי גדילה של Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, ונגזרותיהם מדיהMiddlebrook 7H9 מרק נוזליהכינו תמיסת מלאי 20% Tween-80 על ידי חימום מראש של הנפח הנדרש של מים מזוקקים פעמיים (ddw) בכוס זכוכית ל~45-50 מעלותצלזיוס במיקרוגל, הוסיפו את הנפח הנדרש של Tween-80 באמצעות …

Representative Results

אנו משתמשים ב-M. smegmatis (Msm) כמודל מיקובקטריום כדי להדגים את ההעשרה של mEV מקומיים ורקומביננטיים (R-mEVs). פרוטוקול העשרה סכמטי זה של mEVs (איור 1) פועל גם להעשרה של R-mEV של Msm ושל כלי רכב חשמליים מקומיים של Mtb (עם שינויים קלים כמו בהערות פרוטוקול של 1.2). הדמיה של כלי רכב חשמליים מועשרי?…

Discussion

מאחר שפיתוח חיסון חדשני לשחפת שעדיף על BCG ויכול להחליף אותו נותר אתגר עצום, כחלופה, מספר קבוצות מחפשות גילוי של חיסוני שחפת תת-יחידות שונות שיכולים להגביר את עוצמתו של BCG ולהאריך את משך ההגנה שלו^48,49. בהתחשב בתשומת הלב הגוברת לרכבים חשמליים חיידקיים (bEVs) כתת-יח…

Materials

A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155