Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung nativer mykobakterieller extrazellulärer Vesikel (mEVs) aus axenischen Kulturen von Mycobacterium smegmatis (Msm) und wie mCherry (ein rot fluoreszierender Reporter) enthaltende rekombinante MsmEVs entworfen und angereichert werden können. Schließlich wird der neuartige Ansatz mit der Anreicherung von MsmEVs verifiziert, die das EsxA-Protein von Mycobacterium tuberculosis enthalten.

Abstract

Die meisten Bakterien, einschließlich Mykobakterien, erzeugen extrazelluläre Vesikel (EVs). Da bakterielle EVs (bEVs) eine Untergruppe zellulärer Komponenten enthalten, darunter Metaboliten, Lipide, Proteine und Nukleinsäuren, haben mehrere Gruppen entweder die native oder die rekombinante Version von bEVs auf ihre schützende Wirksamkeit als Impfstoffkandidaten für Untereinheiten untersucht. Im Gegensatz zu nativen EVs sind rekombinante EVs molekular so konstruiert, dass sie ein oder mehrere Immunogene von Interesse enthalten. In den letzten zehn Jahren haben verschiedene Gruppen verschiedene Ansätze zur Erzeugung rekombinanter bEVs erforscht. Hier berichten wir jedoch über das Design, die Konstruktion und die Anreicherung von rekombinanten mykobakteriellen EVs (mEVs) in Mykobakterien. Zu diesem Zweck verwenden wir Mycobacterium smegmatis (Msm), ein avirulentes Bodenmykobakterium, als Modellsystem. Wir beschreiben zunächst die Generierung und Anreicherung nativer Elektrofahrzeuge von MSM. Anschließend beschreiben wir das Design und die Konstruktion von rekombinanten mEVs, die entweder mCherry, ein rot fluoreszierendes Reporterprotein, oder EsxA (Esat-6), ein prominentes Immunogen von Mycobacterium tuberculosis, enthalten. Dies erreichen wir, indem wir mCherry- und EsxA-N-Termini separat mit dem C-Terminus eines kleinen Msm-Proteins Cfp-29 fusionieren. Cfp-29 ist eines der wenigen Proteine, die in MsmEVs reichlich vorhanden sind. Das Protokoll zur Erzeugung und Anreicherung rekombinanter mEVs aus Msm bleibt identisch mit der Generierung und Anreicherung nativer EVs von MSM.

Introduction

Trotz der Entwicklung und Verabreichung einer breiten Palette von Impfstoffen gegen Infektionskrankheiten ereignen sich auch heute noch ~30% aller Todesfälle beim Menschen durch übertragbare Krankheiten¹. Vor dem Aufkommen des Tuberkulose-Impfstoffs – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – war Tuberkulose die häufigste Todesursache (~10.000 bis 15.000/100.000 Einwohner)². Mit der Verabreichung von BCG und dem einfachen Zugang zu Erst- und Zweitlinienmedikamenten gegen Tuberkulose sind die TB-bedingten Todesfälle bis 2022 dramatisch auf ~1 Million/Jahr bis 2022 gesunken (d. h. ~15-20/100.000 Einwohner¹). In den TB-endemischen Populationen der Welt liegt die Zahl der TB-bedingten Todesfälle jedoch weiterhin bei ~100-550/100.000 Einwohnern¹. Während Experten mehrere Gründe erkennen, die zu diesen verzerrten Zahlen führen, scheint der BCG-vermittelte Schutz, der nicht einmal im ersten Lebensjahrzehnt anhält, der Hauptgrund dafür zu sein 3,4,5,6,7. Angesichts der erneuerten “Ziele für nachhaltige Entwicklung” der Vereinten Nationen und der “Strategie zur Beendigung der Tuberkulose” der WHO gibt es daher konzertierte globale Anstrengungen, um eine viel bessere Impfstoffalternative zu BCG zu entwickeln, die möglicherweise einen lebenslangen Schutz vor Tuberkulose bietet.

Um dieses Ziel zu erreichen, evaluieren mehrere Gruppen derzeit modifizierte/rekombinante BCG-Stämme, nicht-pathogene und abgeschwächte Mykobakterienspezies außer BCG und Untereinheitenkandidaten 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Typischerweise handelt es sich bei Subunit-Impfstoffen um Liposomen, die selektiv mit wenigen gereinigten (~1-6) vollständigen (~1-6) immunogenen Proteinen des Erregers beladen sind. Aufgrund ihrer unechten Faltung in nicht-native Konformationen und/oder zufälliger nicht-funktionaler Interaktionen zwischen den beladenen Proteinen fehlen den Untereinheiten jedoch oft native und germane Epitope und sie können das Immunsystem daher nicht ausreichend vorbereiten^14,19,20.

Folglich haben extrazelluläre Vesikel (EVs) von Bakterien als vielversprechende Alternative an Fahrt aufgenommen 21,22,23,24,25,26. Typischerweise enthalten bakterielle EVs (bEVs) eine Teilmenge ihrer zellulären Bestandteile, darunter einige Teile von Nukleinsäuren, Lipiden und Hunderten von Metaboliten und Proteinen^27,28. Im Gegensatz zu Liposomen, bei denen einige wenige gereinigte Proteine künstlich geladen werden, enthalten bEVs Hunderte von natürlich beladenen, nativ gefalteten Proteinen mit einer besseren Neigung, das Immunsystem vorzubereiten, insbesondere ohne den Schub/die Hilfe von Adjuvantien und Toll-like-Rezeptoren (TLR)-Agonisten^27,28,29. In dieser Forschungsrichtung haben wir und andere den Nutzen von mykobakteriellen EVs als potenzielle Untereinheiten-Booster für BCG³⁰ untersucht. Trotz der Befürchtungen, dass bEVs keine einheitlichen Antigenlasten aufweisen, haben EVs aus abgeschwächter Neisseria meningitidis den Menschen erfolgreich vor Meningokokken der Serogruppe B geschützt^31,32.

Zumindest theoretisch sind die besten EVs, die BCG gut steigern könnten, die EVs, die mit pathogenen Bakterien angereichert sind. Die Anreicherung von Elektrofahrzeugen, die durch pathogene Mykobakterien erzeugt werden, ist jedoch teuer, zeitaufwändig und riskant. Darüber hinaus können durch Krankheitserreger erzeugte EVs virulenter als schützend sein. Angesichts der potenziellen Risiken berichten wir hier über ein gut getestetes Protokoll zur Anreicherung von Elektrofahrzeugen, die durch axenisch gezüchtetes MSM, ein avirulentes Mykobakterium, erzeugt werden.

Trotz der Kodierung mehrerer pathogener Proteinorthologe fehlen avirulenten Mykobakterien jedoch mehrere Impfantigene/pathogene Proteinepitope, die notwendig sind, um das Immunsystem ausreichend auf den Schutz vorzubereiten³³. Daher untersuchten wir auch die Konstruktion und Anreicherung rekombinanter EVs von Msm durch molekulares Engineering, so dass ein signifikanter Teil jedes pathogenen Proteins von Interesse, das in Msm exprimiert und translatiert wird, seine EVs erreichen muss. Wir stellten die Hypothese auf, dass eines oder mehrere der 10 am häufigsten vorkommenden Proteine von MSM EVs, wenn sie mit dem interessierenden Protein fusioniert werden, bei einer solchen Translokation helfen.

Während wir 2011 begannen, die Anreicherung von mykobakteriellen EVs (mEVs) in unserem Labor zu standardisieren, berichteten Prados-Rosales et al. erstmals über die Visualisierung und Anreicherung von mEVs in vitro³⁰. Später, im Jahr 2014, veröffentlichte dieselbe Gruppe eine modifizierte Version ihrer Methode³⁴ aus dem Jahr 2011. Im Jahr 2015 berichteten Lee et al. auch über eine unabhängig standardisierte Methode zur mEV-Anreicherung, wiederum aus axenischen Kulturen von Mykobakterien³⁵. Durch die Kombination beider Protokolle 34,35 und die Einbeziehung einiger unserer Modifikationen nach gründlicher Standardisierung beschreiben wir hier ein Protokoll^, das bei der routinemäßigen Anreicherung von mEVs aus axenischen Kulturen von Mykobakterien^{hilft 36}.

Hier gehen wir besonders auf die Anreicherung von MSM-spezifischen EVs ein, die eine Erweiterung eines veröffentlichten Protokolls³⁶ für die Anreicherung von mykobakteriellen EVs im Allgemeinen darstellt. Wir beschreiben auch, wie rekombinante mEVs (R-mEVs) konstruiert werden können, die das mCherry-Protein (als rot fluoreszierender Reporter) und EsxA (Esat-6)^37,38,39 enthalten, ein vorherrschendes Immunogen und eine potenzielle Untereinheit des Vaccinogens von Mycobacterium tuberculosis. Das Protokoll für die Anreicherung der R-mEVs bleibt identisch mit dem, das wir für die Anreicherung nativer EVs von MSM beschrieben haben.

Protocol

1. Wachstumsbedingungen von Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli und ihren Derivaten MedienMiddlebrook 7H9 flüssige BrüheBereiten Sie 20%ige Tween-80-Stammlösung vor, indem Sie das erforderliche Volumen des doppelt destillierten Wassers (ddw) in einem Glasbecherglas in einer Mikrowelle auf ~45-50 °C vorwärmen, das erforderliche Volumen Tween-80 mit einem geeigneten Messzylinder hinzufügen und kontinuierli…

Representative Results

Wir verwenden M. smegmatis (Msm) als Modellmykobakterium, um die Anreicherung sowohl von nativen als auch von rekombinanten mEVs (R-mEVs) zu demonstrieren. Dieses schematisch zusammengefasste mEVs-Anreicherungsprotokoll (Abbildung 1) funktioniert auch für die Anreicherung von R-mEVs von MSM und nativen EVs von Mtb (mit geringfügigen Modifikationen wie in den Protokollanmerkungen von 1.2). Die Visualisierung der angereicherten mEVs erfordert eine negative Färbung unter einem Trans…

Discussion

Da die Entwicklung eines neuartigen TB-Impfstoffs, der BCG überlegen ist und ihn ersetzen kann, nach wie vor eine große Herausforderung darstellt, verfolgen mehrere Gruppen die Entdeckung verschiedener TB-Impfstoffe mit Untereinheiten, die die Wirksamkeit von BCG steigern und seine Schutzdauer verlängern können^48,49. Angesichts der zunehmenden Aufmerksamkeit für bakterielle EVs (bEVs) als potentielle Untereinheiten und als natürliche Adjuvantien<sup class="…

Materials

A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155