Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën

Summary

Dit protocol beschrijft de verrijking van inheemse mycobacteriële extracellulaire vesikels (mEV’s) uit axenische culturen van Mycobacterium smegmatis (Msm) en hoe mCherry (een rode fluorescerende reporter)-bevattende recombinante MsmEV’s kunnen worden ontworpen en verrijkt. Ten slotte verifieert het de nieuwe aanpak met de verrijking van MsmEV’s die het EsxA-eiwit van Mycobacterium tuberculosis bevatten.

Abstract

De meeste bacteriën, waaronder mycobacteriën, genereren extracellulaire blaasjes (EV’s). Aangezien bacteriële EV’s (bEV’s) een subset van cellulaire componenten bevatten, waaronder metabolieten, lipiden, eiwitten en nucleïnezuren, hebben verschillende groepen de native of recombinante versies van bEV’s geëvalueerd op hun beschermende potentie als subeenheid-vaccinkandidaten. In tegenstelling tot native EV’s zijn recombinante EV’s moleculair gemanipuleerd om een of meer immunogenen van belang te bevatten. In het afgelopen decennium hebben verschillende groepen verschillende benaderingen onderzocht voor het genereren van recombinante bEV’s. Hier rapporteren we echter het ontwerp, de constructie en de verrijking van recombinante mycobacteriële EV’s (mEV’s) in mycobacteriën. Daarvoor gebruiken we Mycobacterium smegmatis (Msm), een avirulente bodemmycobacterie als modelsysteem. We beschrijven eerst de generatie en verrijking van native EV’s van Msm. Vervolgens beschrijven we het ontwerp en de constructie van recombinante mEV’s die ofwel mCherry bevatten, een rood fluorescerend reportereiwit, ofwel EsxA (Esat-6), een prominent immunogeen van Mycobacterium tuberculosis. Dit bereiken we door mCherry en EsxA N-termini afzonderlijk te fuseren met de C-terminus van een klein Msm-eiwit Cfp-29. Cfp-29 is een van de weinige overvloedig aanwezige eiwitten van MsmEV’s. Het protocol voor het genereren en verrijken van recombinante mEV’s uit Msm blijft identiek aan het genereren en verrijken van native EV’s van Msm.

Introduction

Ondanks de ontwikkeling en toediening van een breed scala aan vaccins tegen infectieziekten, vindt zelfs tot op de dag van vandaag ~30% van alle menselijke sterfgevallen nog steeds plaats door overdraagbare ziekten^. Vóór de komst van het tuberculosevaccin (tbc) – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – was tuberculose doodsoorzaak nummer één (~10.000 tot 15.000/100.000 inwoners)². Met de toediening van BCG en gemakkelijke toegang tot eerste- en tweedelijns anti-tbc-medicijnen, is het aantal tbc-gerelateerde sterfgevallen in 2022 dramatisch gedaald tot ~1 miljoen/jaar in 2022 (d.w.z. ~15-20/100.000 inwoners¹). In tbc-endemische populaties van de wereld blijven tbc-gerelateerde sterfgevallen echter ~100-550/100.000 inwoners¹. Hoewel experts verschillende redenen erkennen die tot deze scheve cijfers leiden, lijkt BCG-gemedieerde bescherming die zelfs het eerste decennium van het leven niet duurt, de belangrijkste reden te zijn 3,4,5,6,7. Bijgevolg is er, gezien de vernieuwde ‘Sustainable Development Goals’ van de VN en de ‘End TB Strategy’ van de WHO, een gezamenlijke wereldwijde inspanning om een veel beter vaccinalternatief voor BCG te ontwikkelen dat misschien levenslange bescherming tegen tuberculose biedt.

Om dat doel te bereiken, evalueren verschillende groepen momenteel gemodificeerde/recombinante BCG-stammen, niet-pathogene en verzwakte mycobacteriële soorten anders dan BCG, en subeenheidkandidaten 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Doorgaans zijn subeenheidvaccins liposomen die selectief zijn geladen met enkele gezuiverde (~1-6) volledige of afgeknotte immunogene eiwitten van de ziekteverwekker. Echter, vanwege hun onechte vouwen in niet-inheemse conformaties en/of willekeurige niet-functionele interacties tussen de geladen eiwitten, missen subeenheden vaak native en germane epitopen en slagen ze er daarom niet in om het immuunsysteem voldoende te primen^14,19,20.

Bijgevolg zijn extracellulaire blaasjes (EV’s) van bacteriën in een stroomversnelling gekomen als een veelbelovend alternatief 21,22,23,24,25,26. Doorgaans bevatten bacteriële EV’s (bEV’s) een subset van hun cellulaire componenten, waaronder enkele delen nucleïnezuren, lipiden en honderden metabolieten en eiwitten^27,28. In tegenstelling tot liposomen waar een paar gezuiverde eiwitten kunstmatig worden geladen, bevatten bEV’s honderden natuurlijk geladen, native-gevouwen eiwitten met een betere neiging om het immuunsysteem te stimuleren, vooral zonder de boost/hulp van adjuvantia en Toll-like receptor (TLR) agonisten^27,28,29. Het is in deze onderzoekslijn dat wij en anderen het nut van mycobacteriële EV’s hebben onderzocht als potentiële subunit-boosters voor BCG³⁰. Ondanks de bezorgdheid dat bEV’s geen uniforme antigeenbelasting hebben, hebben EV’s van verzwakte Neisseria meningitidis mensen met succes beschermd tegen serogroep B-meningokokken^31,32.

In ieder geval theoretisch zijn de beste EV’s die BCG goed zouden kunnen stimuleren de EV’s die zijn verrijkt met pathogene bacteriën. Het verrijken van EV’s gegenereerd door pathogene mycobacterium is echter duur, tijdrovend en riskant. Bovendien kunnen door ziekteverwekkers gegenereerde EV’s virulenter dan beschermend zijn. Gezien de potentiële risico’s rapporteren we hier een goed getest protocol voor de verrijking van EV’s gegenereerd door axenisch gekweekte Msm, een avirulente mycobacterie.

Ondanks het feit dat ze coderen voor verschillende orthologen van pathogene eiwitten, missen avirulente mycobacteriën verschillende vaccinantigenen/pathogene eiwitepitopen die nodig zijn om het immuunsysteem voldoende voor te bereiden op bescherming³³. Daarom hebben we ook onderzoek gedaan naar het construeren en verrijken van recombinante EV’s van Msm door middel van moleculaire engineering, zodat een aanzienlijk deel van elk pathogeen eiwit dat van belang is en wordt uitgedrukt en vertaald in Msm, zijn EV’s moet bereiken. We veronderstelden dat een of meer van de top 10 overvloedige eiwitten van Msm EV’s, wanneer ze worden gefuseerd met het eiwit van belang, zullen helpen bij een dergelijke translocatie.

Terwijl we begonnen met het standaardiseren van de verrijking van mycobacteriële EV’s (mEV’s) in ons laboratorium, rapporteerden Prados-Rosales et al. in 2011 voor het eerst de visualisatie en verrijking van mEV’s in vitro³⁰. Later, in 2014, publiceerde dezelfde groep een aangepaste versie van hun methode uit 2011³⁴. In 2015 rapporteerden Lee et al. ook een onafhankelijk gestandaardiseerde methode voor mEV-verrijking, opnieuw uit axenische culturen van mycobacteriën³⁵. Door beide protocollen 34,35 te combineren en enkele van onze wijzigingen op te nemen na grondige standaardisatie^, beschrijven we hier een protocol dat helpt bij het routinematig verrijken van mEV’s uit axenische culturen van mycobacteriën³⁶.

Hier beschrijven we in het bijzonder de verrijking van Msm-specifieke EV’s, wat een uitbreiding is van een gepubliceerd protocol³⁶ voor de verrijking van mycobacteriële EV’s in het algemeen. We beschrijven ook hoe we recombinante mEV’s (R-mEV’s) kunnen construeren die het mCherry-eiwit bevatten (als een rode fluorescerende reporter) en EsxA (Esat-6)^37,38,39, een overheersend immunogeen en een potentiële subeenheid vaccinogeen van Mycobacterium tuberculosis. Het protocol voor het verrijken van de R-mEV’s blijft identiek aan het protocol dat we hebben beschreven voor het verrijken van native EV’s van Msm.

Protocol

1. Groeiomstandigheden van Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli en hun derivaten MediaMiddlebrook 7H9 vloeibare bouillonBereid 20% Tween-80 bouillonoplossing door het benodigde volume dubbel gedestilleerd water (ddw) in een glazen bekerglas voor te verwarmen tot ~45-50 °C in een magnetron, voeg het vereiste volume Tween-80 toe met behulp van een geschikte maatcilinder en roer continu op een kleine magnetische r…

Representative Results

We gebruiken M. smegmatis (Msm) als model mycobacterium om de verrijking van zowel native als recombinante mEV’s (R-mEV’s) aan te tonen. Dit schematisch samengevatte mEV’s verrijkingsprotocol (Figuur 1) werkt ook voor de verrijking van R-mEV’s van Msm en native EV’s van Mtb (met kleine aanpassingen zoals in protocolnotities van 1.2). Voor de visualisatie van de verrijkte mEV’s moeten ze negatief worden gekleurd onder een transmissie-elektronenmicroscoop36 (<s…

Discussion

Aangezien het ontwikkelen van een nieuw tbc-vaccin dat superieur is aan BCG en het kan vervangen, een formidabele uitdaging blijft, streven verschillende groepen als alternatief naar de ontdekking van verschillende subeenheid tbc-vaccins die de potentie van BCG kunnen vergroten en de beschermende duur kunnen verlengen^48,49. Gezien de toenemende aandacht voor bacteriële EV’s (bEV’s) als potentiële subeenheden en als natuurlijke hulpstoffen^50,51…

Materials

A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155