यह प्रोटोकॉल माइकोबैक्टीरियम स्मेगमैटिस (एमएसएम) की अक्षीय संस्कृतियों से देशी माइकोबैक्टीरियल बाह्य पुटिकाओं (एमईवी) के संवर्धन का विवरण देता है और कैसे mCherry (एक लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर) युक्त पुनः संयोजक MsmEVs को डिजाइन और समृद्ध किया जा सकता है। अंत में, यह माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस के एस्क्सा प्रोटीन युक्त MsmEVs के संवर्धन के साथ उपन्यास दृष्टिकोण की पुष्टि करता है।
माइकोबैक्टीरिया सहित अधिकांश बैक्टीरिया, बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) उत्पन्न करते हैं। चूंकि बैक्टीरियल ईवीएस (बीईवी) में मेटाबोलाइट्स, लिपिड, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सहित सेलुलर घटकों का एक सबसेट होता है, इसलिए कई समूहों ने सबयूनिट वैक्सीन उम्मीदवारों के रूप में अपनी सुरक्षात्मक शक्ति के लिए बीईवी के मूल या पुनः संयोजक संस्करणों का मूल्यांकन किया है। देशी ईवीएस के विपरीत, पुनः संयोजक ईवीएस को आणविक रूप से ब्याज के एक या अधिक इम्युनोजेन्स को शामिल करने के लिए इंजीनियर किया जाता है। पिछले दशक में, विभिन्न समूहों ने पुनः संयोजक बीईवी उत्पन्न करने के लिए विविध दृष्टिकोणों का पता लगाया है। हालांकि, यहां, हम माइकोबैक्टीरिया में पुनः संयोजक माइकोबैक्टीरियल ईवीएस (एमईवी) के डिजाइन, निर्माण और संवर्धन की रिपोर्ट करते हैं। इसके लिए, हम माइकोबैक्टीरियम स्मेगमैटिस (Msm) का उपयोग करते हैं, जो मॉडल प्रणाली के रूप में एक विषैला मिट्टी माइकोबैक्टीरियम है। हम पहले एमएसएम के देशी ईवीएस की पीढ़ी और संवर्धन का वर्णन करते हैं। फिर, हम पुनः संयोजक mEVs के डिजाइन और निर्माण का वर्णन करते हैं जिसमें या तो mCherry, एक लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन, या EsxA (Esat-6), माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस का एक प्रमुख इम्युनोजेन होता है। हम इसे एक छोटे एमएसएम प्रोटीन सीएफपी -29 के सी-टर्मिनस के साथ अलग से mCherry और EsxA N-termini को फ्यूज करके प्राप्त करते हैं। Cfp-29 MsmEVs के कुछ प्रचुर मात्रा में मौजूद प्रोटीनों में से एक है। एमएसएम से पुनः संयोजक एमईवी उत्पन्न करने और समृद्ध करने का प्रोटोकॉल एमएसएम के देशी ईवी के उत्पादन और संवर्धन के समान है।
संक्रामक रोगों के खिलाफ टीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के विकास और प्रशासन के बावजूद, आज भी, सभी मानव मौतों का ~ 30% अभी भी संचारी रोगों से होता है1. क्षय रोग (टीबी) के टीके के आगमन से पहले – बैसिलस कैलमेट गुएरिन (बीसीजी) – टीबी नंबर एक हत्यारा था (~ 10,000 से 15,000/100,000 जनसंख्या)2. बीसीजी के प्रशासन और पहली और दूसरी पंक्ति की टीबी रोधी दवाओं तक आसान पहुंच के साथ, 2022 तक, टीबी से संबंधित मौतें नाटकीय रूप से घटकर ~1 मिलियन/वर्ष 2022 तक आ गई हैं (यानी, ~15-20/100,000 जनसंख्या1)। हालांकि, दुनिया की टीबी स्थानिक आबादी में, टीबी से संबंधित मौतें ~ 100-550 / 100,000 जनसंख्या1 पर खड़ी हैं। जबकि विशेषज्ञ इन विषम संख्याओं के लिए कई कारणों को पहचानते हैं, बीसीजी-मध्यस्थता सुरक्षा जीवन के पहले दशक तक भी नहीं टिकती है, प्रमुख कारण 3,4,5,6,7 प्रतीत होता है। नतीजतन, संयुक्त राष्ट्र के नए सिरे से ‘सतत विकास लक्ष्यों’ और डब्ल्यूएचओ की ‘टीबी उन्मूलन रणनीति’ को देखते हुए, बीसीजी के लिए एक बेहतर टीका विकल्प विकसित करने के लिए एक ठोस वैश्विक प्रयास है जो शायद टीबी से आजीवन सुरक्षा प्रदान करता है।
उस उद्देश्य की ओर, कई समूह वर्तमान में बीसीजी के अलावा संशोधित/पुनः संयोजक उपभेदों, गैर-रोगजनक और क्षीण माइकोबैक्टीरियल प्रजातियों का मूल्यांकन कर रहे हैं, और सबयूनिट उम्मीदवार 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . आमतौर पर, सबयूनिट टीके लिपोसोम होते हैं जो चुनिंदा रूप से रोगज़नक़ के कुछ शुद्ध (~ 1-6) पूर्ण-लंबाई या काटे गए इम्युनोजेनिक प्रोटीन से भरे होते हैं। हालांकि, गैर-देशी अनुरूपताओं और/या लोड किए गए प्रोटीनों के बीच यादृच्छिक गैर-कार्यात्मक बातचीत में उनके नकली तह के कारण, सबयूनिट्स में अक्सर देशी और जर्मन एपिटोप्स की कमी होती है और इसलिए, प्रतिरक्षा प्रणाली14,19,20 को पर्याप्त रूप से प्राइम करने में विफल रहते हैं।
नतीजतन, बैक्टीरिया के बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) ने एक आशाजनक विकल्प के रूप में गति पकड़ी है 21,22,23,24,25,26. आमतौर पर, बैक्टीरियल ईवीएस (बीईवी) में उनके सेलुलर घटकों का एक सबसेट होता है, जिसमें न्यूक्लिक एसिड, लिपिड और सैकड़ों मेटाबोलाइट्स और प्रोटीन27,28के कुछ हिस्से शामिल हैं। लिपोसोम के विपरीत जहां कुछ शुद्ध प्रोटीन कृत्रिम रूप से लोड होते हैं, बीईवी में सैकड़ों स्वाभाविक रूप से भरी हुई, मूल रूप से मुड़े हुए प्रोटीन होते हैं, जो प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रमुख बनाने के लिए बेहतर प्रवृत्ति के साथ होते हैं, विशेष रूप से सहायक और टोल-जैसे रिसेप्टर (टीएलआर) एगोनिस्ट27,28,29 के बूस्ट/सहायता के बिना। यह अनुसंधान की इस पंक्ति में है कि हमने और अन्य ने बीसीजी30 के लिए संभावित सबयूनिट बूस्टर के रूप में माइकोबैक्टीरियल ईवीएस की उपयोगिता का पता लगाया है। चिंताओं के बावजूद कि बीईवी में समान एंटीजन लोड की कमी है, क्षीण नेइसेरिया मेनिंगिटिडिस से ईवीएस ने सफलतापूर्वक सेरोग्रुप बी मेनिंगोकोकस31,32 के खिलाफ मनुष्यों की रक्षा की है।
कम से कम सैद्धांतिक रूप से, सबसे अच्छा ईवी जो बीसीजी को अच्छी तरह से बढ़ावा दे सकता है, वे रोगजनक बैक्टीरिया से समृद्ध ईवीएस हैं। हालांकि, रोगजनक माइकोबैक्टीरियम द्वारा उत्पन्न ईवीएस को समृद्ध करना महंगा, समय लेने वाला और जोखिम भरा है। इसके अतिरिक्त, रोगज़नक़ जनित ईवीएस सुरक्षात्मक की तुलना में अधिक विषैले हो सकते हैं। संभावित जोखिमों को देखते हुए, यहां, हम अक्षीय रूप से उगाए गए एमएसएम, एक एविरुलेंट माइकोबैक्टीरियम द्वारा उत्पन्न ईवीएस के संवर्धन के लिए एक अच्छी तरह से परीक्षण किए गए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।
हालांकि, कई रोगज़नक़ प्रोटीन ऑर्थोलॉग एन्कोडिंग के बावजूद, एविरुलेंट माइकोबैक्टीरिया में कई वैक्सीन एंटीजन/रोगजनक प्रोटीन एपिटोप्स की कमी होती है जो प्रतिरक्षा प्रणाली को सुरक्षा33 की दिशा में पर्याप्त रूप से प्राइम करने के लिए आवश्यक होते हैं। इसलिए, हमने आणविक इंजीनियरिंग के माध्यम से एमएसएम के पुनः संयोजक ईवीएस के निर्माण और समृद्ध करने का भी पता लगाया, जैसे कि एमएसएम में व्यक्त और अनुवादित ब्याज के किसी भी रोगजनक प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा, अपने ईवीएस तक पहुंचना चाहिए। हमने अनुमान लगाया कि एमएसएम ईवीएस के शीर्ष 10 प्रचुर मात्रा में प्रोटीन में से एक या अधिक जब ब्याज के प्रोटीन से जुड़े होते हैं, तो इस तरह के अनुवाद में सहायता मिलेगी।
जबकि हम अपनी प्रयोगशाला में माइकोबैक्टीरियल ईवीएस (एमईवी) के संवर्धन को मानकीकृत करना शुरू कर रहे थे, 2011 में, प्राडोस-रोजलेस एट अल ने पहली बार इन विट्रो30 में एमईवी के विज़ुअलाइज़ेशन और संवर्धन की सूचना दी। बाद में, 2014 में, उसी समूह ने अपनी 2011 विधि34 का एक संशोधित संस्करण प्रकाशित किया। 2015 में, ली एट अल ने माइकोबैक्टीरिया35 के अक्षीय संस्कृतियों से फिर से एमईवी संवर्धन के लिए एक स्वतंत्र रूप से मानकीकृत विधि की सूचना दी। दोनों प्रोटोकॉल34,35 के संयोजन और पूरी तरह से मानकीकरण के बाद हमारे संशोधनों में से कुछ को शामिल करते हुए, हम यहां एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो माइकोबैक्टीरिया 36 की अक्षीय संस्कृतियों से नियमित रूप से समृद्ध एमईवी में मदद करता है।
यहां, हम विशेष रूप से एमएसएम-विशिष्ट ईवीएस के संवर्धन का विस्तार करते हैं, जो सामान्य रूप से माइकोबैक्टीरियल ईवीएस के संवर्धन के लिए प्रकाशित प्रोटोकॉल36 का विस्तार है। हम यह भी विस्तार से बताते हैं कि पुनः संयोजक mEVs (R-mEVs) का निर्माण कैसे किया जाए जिसमें mCherry प्रोटीन (लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के रूप में) और EsxA (Esat-6)37,38,39 एक प्रमुख इम्युनोजेन और माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस का एक संभावित सबयूनिट वैक्सीनोजेन शामिल है। आर-एमईवी को समृद्ध करने के लिए प्रोटोकॉल उसी के समान है जिसे हमने एमएसएम से देशी ईवीएस को समृद्ध करने के लिए वर्णित किया है।
चूंकि एक नया टीबी वैक्सीन विकसित करना जो बीसीजी से बेहतर है और उसकी जगह ले सकता है, एक विकल्प के रूप में, कई समूह विभिन्न सबयूनिट टीबी टीकों की खोज का पीछा कर रहे हैं जो बीसीजी की शक्ति को बढ़ा सकते हैं और ?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक ईमानदारी से प्रो सारा एम. फॉर्च्यून को धन्यवाद देते हैं कि कृपया एम. स्मेगमैटिस एमसी2155 स्टॉक साझा करें। वे चित्रा 1 के लिए कुछ बुनियादी तत्व प्रदान करने के लिए सर्वियर मेडिकल आर्ट (smart.servier.com) को भी स्वीकार करते हैं। वे ईमानदारी से एमईवी संवर्धन के लिए इनक्यूबेटर शेकर्स, सेंट्रीफ्यूज और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज के लंबे उपयोग के दौरान अपने रोगी समायोजन के लिए बाकी प्रयोगशाला सदस्यों के समर्थन को स्वीकार करते हैं। वे प्रयोगशाला सहायक श्री सुरजीत यादव को भी हमेशा यह सुनिश्चित करने के लिए स्वीकार करते हैं कि आवश्यक कांच के बने पदार्थ और उपभोग्य वस्तुएं हमेशा उपलब्ध और आसान हों। अंत में, वे THSTI की प्रशासनिक, खरीद और वित्त टीमों को उनके निरंतर समर्थन और परियोजना के निर्बाध निष्पादन में मदद के लिए स्वीकार करते हैं।
A2 type Biosafety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, USA | 1300 series | |
Bench top Centrifuge | Eppendorf, USA | 5810 R | |
BstB1, HindIII, HpaI | NEB, USA | NEB | |
Cell densitometer | GE Healthcare, USA | Ultraspec 10 | |
Citric Acid | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Dibasic Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Double Distilled Water | Merck, USA | ~18.2 MW/cm @ 25 oC | |
Electroporation cuvettes | Bio-Rad, USA | 2 mm | |
Electroporator | Bio-Rad, USA | Electroporator | |
EsxA-specific Ab | Abcam, UK | Rabbit polyclonal | |
Ferric Ammonium Citrate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Floor model centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | Sorvall RC6 plus | |
Glassware | Borosil, INDIA | 1 L Erlenmeyer flasks | |
Glycerol | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
HEPES and Sodium Chloride | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Incubator shakers | Thermo Fisher Scientific, USA | MaxQ 6000 & 8000 | |
L-Asparagine | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Luria Bertani Broth and Agar, Miller | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Magnetic stirrer | Tarsons, INDIA | Tarsons | |
mCherry-specific Ab | Abcam, UK | Rabbit monoclonal | |
Microwave | LG, INDIA | MC3286BLT | |
Middlebrook 7H9 Broth | BD, USA | Difco Middlebrook 7H9 Broth | |
Middlebrook ADC enrichment | BD, USA | BBL Middlebrook ADC enrichment | |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, USA | Spectronic 200 UV-Vis | |
NEB5a | NEB, USA | a derivative of DH5a | |
Optiprep (Iodixanol) | Merck, USA | Available as 60% stock solution (in water) | |
PCR purification kit | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
pH Meter | Mettler Toledo, USA | Mettler Toledo | |
Plasmid DNA mini kit | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
Plate incubator | Thermo Fisher Scientific, USA | New Series | |
Plasmid pMV261 | Addgene, USA * *The plasmid is no more available in this plasmid bank |
Shuttle vector | |
Proof-reading DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific, USA | Phusion DNA Plus Polymerase | |
Q5 Proof-reading DNA Polymerase | NEB, USA | NEB | |
Refrigerated circulating water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | R20 | |
Middlebrock 7H11 Agar base | BD, USA | BBL Seven H11 Agar base | |
SOC broth | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
T4 DNA Ligase | NEB, USA | NEB | |
Tween-80 | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter, USA | Optima L100K | |
Ultracentrifuge tubes – 14 mL | Beckman Coulter, USA | Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor | |
Ultracentrifuge tubes – 38 mL | Beckman Coulter, USA | Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor | |
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator | Thermo Fisher Scientific, USA | Sonicator – bench top model | |
0.22 µm Disposable filters | Thermo Fisher Scientific, USA | Nunc-Nalgene | |
30-kDa Centricon concentrators | Merck, USA | Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore | |
3X FLAG antibody | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
400 mL Centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific, USA | Nunc-Nalgene | |
50 mL Centrifuge tubes | Corning, USA | Sterile, pre-packed | |
Bacteria | |||
Strain | |||
Escherichia coli | NEB, USA | NEB 5-alpha (a derivative of DH5α). | |
Msm expressing cfp29::mCherry | This study | MC2 155 | |
Msm expressing cfp29::esxA | This study | MC2 155 | |
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG | This study | MC2 155 | |
Mycobacterium smegmatis (Msm) | Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA | MC2 155 |