マイコバクテリアの天然および組換え細胞外小胞の濃縮
Summary
このプロトコルでは、マイコバクテリウム・スメグマティス(Msm)の軸種培養からの天然マイコバクテリア細胞外小胞(mEV)の濃縮と、mCherry(赤色蛍光レポーター)含有組換えMsmEVsの設計と濃縮方法について詳しく説明します。最後に、結核菌のEsxAタンパク質を含むMsmEVを濃縮することで、新しいアプローチを検証します。
Abstract
マイコバクテリアを含むほとんどの細菌は、細胞外小胞(EV)を生成します。細菌EV(bEV)には、代謝物、脂質、タンパク質、核酸などの細胞成分のサブセットが含まれているため、いくつかのグループが、サブユニットワクチン候補としての防御力について、bEVのネイティブバージョンまたは組換えバージョンのいずれかを評価しています。ネイティブEVとは異なり、組換えEVは、目的の免疫原を1つ以上含むように分子操作されています。過去10年間、さまざまなグループが組換え型bEVを生成するための多様なアプローチを模索してきました。しかし、ここでは、マイコバクテリアにおける組換えマイコバクテリアEV(mEV)の設計、構築、および濃縮について報告します。そのために、菌性土壌マイコバクテリウムである マイコバクテリウム・スメグマティス (Msm)をモデルシステムとして用いています。まず、MsmのネイティブEVの生成とエンリッチメントについて説明します。次に、赤色蛍光レポータータンパク質であるmCherry、または 結核菌の代表的な免疫原であるEsxA(Esat-6)のいずれかを含む組換えmEVの設計と構築について説明します。これは、mCherryとEsxAのN末端を、小さなMsmタンパク質Cfp-29のC末端と別々に融合させることで実現しています。 Cfp-29は、MsmEVに豊富に存在する数少ないタンパク質の1つです。Msm から組換え mEV を生成して濃縮するプロトコルは、Msm のネイティブ EV の生成と濃縮と同じままです。
Introduction
感染症に対する幅広いワクチンが開発・投与されているにもかかわらず、今日でも全死亡の~30%が伝染病によるものです1。結核(TB)ワクチンであるカルメット・ゲラン菌(BCG)が登場する前は、結核が死因の第1位でした(人口10万人あたり10,000~15,000人)2。BCGの投与と第一選択薬と第二選択薬の入手の容易さにより、2022年までに結核関連の死亡は劇的に減少し、2022年までに年間~100万人(すなわち、人口10万人あたり~15-20人)になりました1。しかし、世界の結核流行集団では、結核関連の死亡者数は人口10万人あたり100~550人にとどまっています1。専門家は、これらの数値の歪みにつながるいくつかの理由を認識していますが、BCGを介した保護が生後10年間も持続しないことが、3,4,5,6,7の顕著な理由のようです。その結果、国連の「持続可能な開発目標」とWHOの「結核撲滅戦略」が新たに採択されたことから、BCGに代わる、結核を生涯にわたって防ぐことができる、はるかに優れたワクチンを開発するための世界的な取り組みが世界的に協力して行われています。
その目的に向けて、いくつかのグループが現在、修飾/組換えBCG株、BCG以外の非病原性および弱毒化マイコバクテリア種、およびサブユニット候補8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18を評価しています.典型的には、サブユニットワクチンは、病原体の精製された(~1-6)完全長または切断された免疫原性タンパク質を数個選択的にロードしたリポソームである。しかし、非天然のコンフォメーションへの偽の折り畳みや、ロードされたタンパク質間のランダムな非機能的相互作用のために、サブユニットはしばしば天然およびゲルマンエピトープを欠いており、したがって、免疫系を十分に呼び起こすことができません14,19,20。
その結果、細菌の細胞外小胞(EV)は、有望な代替手段としてペースを上げています21,22,23,24,25,26。典型的には、細菌のEV(bEV)には、核酸、脂質の一部、数百の代謝物やタンパク質など、細胞成分のサブセットが含まれています27,28。少数の精製タンパク質が人工的にロードされるリポソームとは異なり、bEVには、特にアジュバントやToll様受容体(TLR)アゴニストのブースト/補助なしに、免疫系をプライミングする傾向が優れた、自然にロードされたネイティブフォールドタンパク質が何百個も含まれています27,28,29。この研究ラインにおいて、私たちや他の研究者は、BCG30のサブユニットブースターとしてのマイコバクテリアEVの有用性を探ってきました。bEVは均一な抗原負荷を欠いているという懸念にもかかわらず、弱毒化髄膜炎菌由来のEVは、血清型B髄膜炎菌からヒトを保護することに成功しています31,32。
少なくとも理論的には、BCGをうまく高めることができる最高のEVは、病原菌を豊富に含むEVです。しかし、病原性マイコバクテリウムによって生成されたEVを濃縮するには、費用と時間がかかり、リスクが伴います。さらに、病原体が生成するEVは、防御よりも毒性が強い可能性があります。潜在的なリスクを考慮して、ここでは、アキセンで増殖したマイコバクテリウムであるMsmによって生成されたEVを濃縮するための十分にテストされたプロトコルを報告します。
しかし、いくつかの病原体タンパク質オルソログをコードしているにもかかわらず、ウイルス性マイコバクテリアは、免疫系を防御に向けて十分にプライミングするために必要ないくつかのワクチン抗原/病原性タンパク質エピトープを欠いています33。そこで、分子工学を通じて、Msmで発現・翻訳された病原性タンパク質のかなりの部分がEVに到達するように、Msmの組換えEVを構築し、濃縮することも検討しました。我々は、Msm EVの上位10個の豊富なタンパク質のうちの1つ以上が、目的のタンパク質に融合すると、そのような転座を助けるという仮説を立てました。
2011年、Prados-Rosalesらは、マイコバクテリアEV(mEV)の濃縮を研究室で標準化し始めていましたが、in vitro30で初めてmEVの可視化と濃縮を報告しました。その後、2014年に同じグループが2011年のメソッド34の修正版を発表しました。2015年、Leeらは、マイコバクテリアの軸培養物からmEVを濃縮するための独立して標準化された方法も報告しました35。両方のプロトコル34,35を組み合わせ、徹底的な標準化の後にいくつかの変更を組み込んで、マイコバクテリア36の軸培養物からのmEVを日常的に濃縮するのに役立つプロトコルをここで説明します。
ここでは、マイコバクテリアEV全般の濃縮のために公開されているプロトコル36の拡張である、Msm特異的EVの濃縮について特に詳しく説明します。また、mCherryタンパク質(赤色蛍光レポーターとして)と、結核菌の主要な免疫原であり、サブユニットワクチンの候補であるEsxA(Esat-6)37,38,39を含む組換えmEV(R-mEV)の構築方法についても詳しく説明します。R-mEVを濃縮するためのプロトコルは、MsmのネイティブEVを濃縮するために説明したものと同じです。
Protocol
Representative Results
Discussion
BCGよりも優れており、BCGに取って代わることができる新しい結核ワクチンの開発は依然として手ごわい課題であるため、代替案として、いくつかのグループは、BCGの効力を高め、その保護期間を延長できるさまざまなサブユニット結核ワクチンの発見を追求しています48,49。潜在的なサブユニットとして、また天然アジュバントとしての細菌EV(bEV)?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、 M. smegmatis mc2155 株を親切に共有してくださった Sarah M. Fortune 教授に心から感謝します。また、Servier Medical Art (smart.servier.com) が 図 1 にいくつかの基本要素を提供してくれたことも評価されています。彼らは、mEV濃縮のためのインキュベーターシェーカー、遠心分離機、超遠心分離機の長期使用中に忍耐強く調整してくれた他のラボメンバーのサポートに心から感謝しています。また、研究室助手のSurjeet Yadav氏には、必要なガラス器具や消耗品が常に手元にあることを常に確認していたことに感謝しています。最後に、THSTIの管理、購買、財務の各チームには、プロジェクトのシームレスな実行を継続的にサポートし、支援していただいたことに感謝しています。
Materials
| A2 type Biosafety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, USA | 1300 series | |
| Bench top Centrifuge | Eppendorf, USA | 5810 R | |
| BstB1, HindIII, HpaI | NEB, USA | NEB | |
| Cell densitometer | GE Healthcare, USA | Ultraspec 10 | |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Dibasic Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Double Distilled Water | Merck, USA | ~18.2 MW/cm @ 25 oC | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad, USA | 2 mm | |
| Electroporator | Bio-Rad, USA | Electroporator | |
| EsxA-specific Ab | Abcam, UK | Rabbit polyclonal | |
| Ferric Ammonium Citrate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Floor model centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | Sorvall RC6 plus | |
| Glassware | Borosil, INDIA | 1 L Erlenmeyer flasks | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| HEPES and Sodium Chloride | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Incubator shakers | Thermo Fisher Scientific, USA | MaxQ 6000 & 8000 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Luria Bertani Broth and Agar, Miller | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Magnetic stirrer | Tarsons, INDIA | Tarsons | |
| mCherry-specific Ab | Abcam, UK | Rabbit monoclonal | |
| Microwave | LG, INDIA | MC3286BLT | |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD, USA | Difco Middlebrook 7H9 Broth | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD, USA | BBL Middlebrook ADC enrichment | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, USA | Spectronic 200 UV-Vis | |
| NEB5a | NEB, USA | a derivative of DH5a | |
| Optiprep (Iodixanol) | Merck, USA | Available as 60% stock solution (in water) | |
| PCR purification kit | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
| pH Meter | Mettler Toledo, USA | Mettler Toledo | |
| Plasmid DNA mini kit | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
| Plate incubator | Thermo Fisher Scientific, USA | New Series | |
| Plasmid pMV261 | Addgene, USA * *The plasmid is no more available in this plasmid bank |
Shuttle vector | |
| Proof-reading DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific, USA | Phusion DNA Plus Polymerase | |
| Q5 Proof-reading DNA Polymerase | NEB, USA | NEB | |
| Refrigerated circulating water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | R20 | |
| Middlebrock 7H11 Agar base | BD, USA | BBL Seven H11 Agar base | |
| SOC broth | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| T4 DNA Ligase | NEB, USA | NEB | |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, USA | Optima L100K | |
| Ultracentrifuge tubes – 14 mL | Beckman Coulter, USA | Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes – 38 mL | Beckman Coulter, USA | Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor | |
| Ultrasonics cleaning waterbath sonicator | Thermo Fisher Scientific, USA | Sonicator – bench top model | |
| 0.22 µm Disposable filters | Thermo Fisher Scientific, USA | Nunc-Nalgene | |
| 30-kDa Centricon concentrators | Merck, USA | Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore | |
| 3X FLAG antibody | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| 400 mL Centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific, USA | Nunc-Nalgene | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Corning, USA | Sterile, pre-packed | |
| Bacteria | |||
| Strain | |||
| Escherichia coli | NEB, USA | NEB 5-alpha (a derivative of DH5α). | |
| Msm expressing cfp29::mCherry | This study | MC2 155 | |
| Msm expressing cfp29::esxA | This study | MC2 155 | |
| Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG | This study | MC2 155 | |
| Mycobacterium smegmatis (Msm) | Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA | MC2 155 |
Referências
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