Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Summary

Este protocolo detalha o enriquecimento de vesículas extracelulares de micobactérias nativas (mEVs) de culturas axênicas de Mycobacterium smegmatis (Msm) e como mCherry (um repórter fluorescente vermelho) contendo MsmEVs recombinantes pode ser projetado e enriquecido. Por fim, verifica-se a nova abordagem com o enriquecimento de MsmEVs contendo a proteína EsxA do Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

A maioria das bactérias, incluindo as micobactérias, gera vesículas extracelulares (EVs). Uma vez que os EVs bacterianos (bEVs) contêm um subconjunto de componentes celulares, incluindo metabólitos, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, vários grupos avaliaram as versões nativas ou recombinantes de bEVs por sua potência protetora como candidatos a vacinas de subunidades. Ao contrário dos EVs nativos, os EVs recombinantes são projetados molecularmente para conter um ou mais imunógenos de interesse. Na última década, diferentes grupos têm explorado diversas abordagens para a geração de bEVs recombinantes. No entanto, aqui relatamos o projeto, construção e enriquecimento de EVs micobacterianos recombinantes (mEVs) em micobactérias. Para tanto, utilizamos como sistema modelo o Mycobacterium smegmatis (Msm), uma micobactéria avirulenta do solo. Primeiramente descrevemos a geração e o enriquecimento de EVs nativos de Msm. Em seguida, descrevemos o projeto e a construção de mEVs recombinantes que contêm mCherry, uma proteína repórter fluorescente vermelha, ou EsxA (Esat-6), um imunógeno proeminente do Mycobacterium tuberculosis. Conseguimos isso fundindo separadamente mCherry e EsxA N-termini com o término C de uma pequena proteína Msm Cfp-29. Cfp-29 é uma das poucas proteínas abundantemente presentes de MsmEVs. O protocolo para gerar e enriquecer mEVs recombinantes a partir de Msm permanece idêntico à geração e enriquecimento de EVs nativos de Msm.

Introduction

Apesar do desenvolvimento e administração de uma ampla gama de vacinas contra doenças infecciosas, até hoje, ~30% de todas as mortes humanas ainda ocorrem por doenças transmissíveis¹. Antes do advento da vacina contra a tuberculose (TB) – Bacilo Calmette Guerin (BCG) – a TB era a principal causa de morte (~10.000 a 15.000/100.000 habitantes)². Com a administração de BCG e o fácil acesso a medicamentos anti-TB de primeira e segunda linha, em 2022, as mortes relacionadas à TB caíram drasticamente para ~1 milhão/ano em 2022 (ou seja, ~15-20/100.000 habitantes¹). No entanto, em populações endêmicas de TB do mundo, as mortes relacionadas à TB continuam a ser de ~100-550/100.000 habitantes¹. Embora os especialistas reconheçam várias razões que levam a esses números distorcidos, a proteção mediada por BCG que não dura nem mesmo a primeira década de vida parece ser a razão proeminente 3,4,5,6,7. Consequentemente, dados os renovados “Objetivos de Desenvolvimento Sustentável” da ONU e a “Estratégia para Acabar com a TB”, da OMS, há um esforço global concertado para desenvolver uma alternativa vacinal muito superior à BCG que talvez forneça proteção vitalícia contra a TB.

Com esse objetivo, vários grupos estão atualmente avaliando cepas de BCG modificadas/recombinantes, espécies de micobactérias não patogênicas e atenuadas que não a BCG e candidatas a subunidades 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Normalmente, as vacinas de subunidades são lipossomas seletivamente carregadas com poucas proteínas imunogênicas purificadas (~1-6) completas ou truncadas do patógeno. No entanto, devido ao seu enovelamento espúrio em conformações não-nativas e/ou interações aleatórias não funcionais entre as proteínas carregadas, as subunidades frequentemente carecem de epítopos nativos e alemães e, portanto, não conseguem preparar suficientemente o sistema imune^14,19,20.

Consequentemente, vesículas extracelulares (EVs) de bactérias têm ganhado ritmo como uma alternativa promissora21,22,23,24,25,26. Tipicamente, os EVs bacterianos (bEVs) contêm um subconjunto de seus componentes celulares, incluindo algumas porções de ácidos nucléicos, lipídios e centenas de metabólitos e proteínas^27,28. Ao contrário dos lipossomas, onde algumas proteínas purificadas são carregadas artificialmente, os bEVs contêm centenas de proteínas naturalmente carregadas, dobradas nativamente, com maior propensão a estimular o sistema imunológico, especialmente sem o impulso/auxílio de adjuvantes e agonistas do receptor Toll-like (TLR)^27,28,29. É nessa linha de pesquisa que nós e outros exploramos a utilidade dos EVs micobacterianos como potenciais impulsionadores de subunidades para BCG³⁰. Apesar das preocupações de que os bEVs não possuem cargas antigênicas uniformes, EVs de Neisseria meningitidis atenuada têm protegido com sucesso os humanos contra o meningococo do sorogrupo B^31,32.

Pelo menos teoricamente, os melhores EVs que poderiam impulsionar bem o BCG são os EVs enriquecidos a partir de bactérias patogênicas. No entanto, o enriquecimento de EVs gerados por micobactérias patogênicas é caro, demorado e arriscado. Além disso, os EVs gerados por patógenos podem ser mais virulentos do que protetores. Diante dos riscos potenciais, relatamos aqui um protocolo bem testado para o enriquecimento de EVs gerados por Msm, uma micobactéria avirulenta cultivada axenicamente.

No entanto, apesar de codificarem vários ortólogos de proteínas patogênicas, as micobactérias avirulentas carecem de vários antígenos vacinais/epítopos proteicos patogênicos necessários para preparar suficientemente o sistema imune em direção à proteção³³. Portanto, também exploramos a construção e o enriquecimento de EVs recombinantes de Msm por meio de engenharia molecular, de modo que uma parcela significativa de qualquer proteína patogênica de interesse expressa e traduzida em Msm, deve atingir seus EVs. Nós hipotetizamos que uma ou mais das 10 principais proteínas abundantes de Msm EVs, quando fundidas à proteína de interesse, ajudarão nessa translocação.

Enquanto estávamos começando a padronizar o enriquecimento de EVs micobacterianos (mEVs) em nosso laboratório, em 2011, Prados-Rosales et al., pela primeira vez, relataram a visualização e o enriquecimento de mEVs in vitro³⁰. Posteriormente, em 2014, o mesmo grupo publicou uma versão modificada de seu método de 2011³⁴. Em 2015, Lee e col. também relataram um método padronizado independentemente para enriquecimento de mEV novamente a partir de culturas axênicas de micobactérias³⁵. Combinando ambos os protocolos^34,35 e incorporando algumas de nossas modificações após padronização completa^, descrevemos aqui um protocolo que ajuda a enriquecer rotineiramente mEVs de culturas axênicas de micobactérias³⁶.

Aqui, detalhamos particularmente o enriquecimento de EVs Msm-específicos, que é uma extensão de um protocolo publicado³⁶ para o enriquecimento de EVs micobacterianos em geral. Também detalhamos como construir mEVs recombinantes (R-mEVs) que contêm a proteína mCherry (como um repórter fluorescente vermelho) e EsxA (Esat-6)^37,38,39, um imunógeno predominante e uma potencial subunidade vacinal do Mycobacterium tuberculosis. O protocolo para o enriquecimento dos R-mEVs permanece idêntico ao que descrevemos para o enriquecimento dos EVs nativos de Msm.

Protocol

1. Condições de crescimento de Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli e seus derivados MídiaCaldo líquido Middlebrook 7H9Prepare a solução-estoque de Tween-80 a 20% pré-aquecendo o volume necessário de água bidestilada (ddw) em um copo de vidro a ~45-50 o C em um micro-ondas, adicione o volume necessário de Tween-80 usando um cilindro de medição apropriado e mexa continuamente em um pequeno agitador magnético pa…

Representative Results

Usamos M. smegmatis (Msm) como micobactéria modelo para demonstrar o enriquecimento de mEVs nativos e recombinantes (R-mEVs). Este protocolo de enriquecimento de mEVs esquematicamente resumido (Figura 1) também funciona para o enriquecimento de R-mEVs de Msm e EVs nativos de Mtb (com pequenas modificações como nas notas de protocolo de 1.2). A visualização dos mEVs enriquecidos requer coloração negativa em microscópio eletrônico de transmissão36 (<…

Discussion

Uma vez que o desenvolvimento de uma nova vacina contra TB que seja superior e possa substituir a BCG continua sendo um desafio formidável, como alternativa, vários grupos estão buscando a descoberta de diferentes vacinas contra TB de subunidades que possam aumentar a potência da BCG e estender sua duração protetora^48,49. Dada a crescente atenção aos EVs bacterianos (bEVs) como subunidades potenciais e como adjuvantes naturais^50,51…

Materials

A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155