Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

Summary

Este protocolo detalla el enriquecimiento de vesículas extracelulares micobacterianas nativas (mEVs) de cultivos axénicos de Mycobacterium smegmatis (Msm) y cómo se pueden diseñar y enriquecer msmEVs recombinantes que contienen mCherry (un reportero fluorescente rojo). Por último, se verifica el novedoso enfoque con el enriquecimiento de MsmEVs que contienen la proteína EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

La mayoría de las bacterias, incluidas las micobacterias, generan vesículas extracelulares (VE). Dado que las VE bacterianas (bEV) contienen un subconjunto de componentes celulares, incluidos metabolitos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, varios grupos han evaluado las versiones nativas o recombinantes de las bEV por su potencia protectora como candidatas a vacunas de subunidades. A diferencia de los VE nativos, los VE recombinantes están diseñados molecularmente para contener uno o más inmunógenos de interés. A lo largo de la última década, diferentes grupos han explorado diversos enfoques para generar bEVs recombinantes. Sin embargo, aquí informamos sobre el diseño, la construcción y el enriquecimiento de las VE micobacterianas recombinantes (mEV) en micobacterias. Para ello, utilizamos Mycobacterium smegmatis (Msm), una micobacteria avirulenta del suelo como sistema modelo. En primer lugar, describimos la generación y el enriquecimiento de los vehículos eléctricos nativos de MSM. A continuación, describimos el diseño y la construcción de mEVs recombinantes que contienen mCherry, una proteína reportera fluorescente roja, o EsxA (Esat-6), un inmunógeno prominente de Mycobacterium tuberculosis. Logramos esto fusionando por separado mCherry y EsxA N-terminal con el extremo C-terminal de una pequeña proteína Msm Cfp-29. Cfp-29 es una de las pocas proteínas abundantemente presentes de MsmEVs. El protocolo para generar y enriquecer mEVs recombinantes a partir de Msm sigue siendo idéntico a la generación y enriquecimiento de EVs nativos de Msm.

Introduction

A pesar del desarrollo y la administración de una amplia gama de vacunas contra enfermedades infecciosas, incluso hasta el día de hoy, ~ 30% de todas las muertes humanas todavía ocurren por enfermedades transmisibles¹. Antes de la llegada de la vacuna contra la tuberculosis (TB) – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – la tuberculosis era la principal causa de muerte (~10.000 a 15.000/100.000 habitantes)². Con la administración de BCG y el fácil acceso a medicamentos antituberculosos de primera y segunda línea, para 2022, las muertes relacionadas con la tuberculosis se han reducido drásticamente a ~ 1 millón/año para 2022 (es decir, ~ 15-20/100,000 habitantes¹). Sin embargo, en las poblaciones endémicas de tuberculosis del mundo, las muertes relacionadas con la tuberculosis siguen siendo de ~100-550/100.000 habitantes¹. Si bien los expertos reconocen varias razones que conducen a estos números sesgados, la protección mediada por BCG que no dura ni siquiera la primera década de vida parece ser la razón principal 3,4,5,6,7. En consecuencia, dados los renovados “Objetivos de Desarrollo Sostenible” de las Naciones Unidas y la “Estrategia para poner fin a la tuberculosis” de la OMS, existe un esfuerzo mundial concertado para desarrollar una vacuna alternativa muy superior a la BCG que tal vez proporcione protección de por vida contra la tuberculosis.

Con ese objetivo, varios grupos están evaluando actualmente cepas de BCG modificadas/recombinantes, especies micobacterianas no patógenas y atenuadas distintas de BCG, y candidatos a subunidades 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Por lo general, las vacunas de subunidades son liposomas cargados selectivamente con pocas proteínas inmunogénicas purificadas (~ 1-6) de longitud completa o truncadas del patógeno. Sin embargo, debido a su plegamiento espurio en conformaciones no nativas y/o interacciones aleatorias no funcionales entre las proteínas cargadas, las subunidades a menudo carecen de epítopos nativos y pertinentes y, por lo tanto, no preparan suficientemente el sistema inmune^14,19,20.

En consecuencia, las vesículas extracelulares (VE) de las bacterias se han acelerado como una alternativa prometedora 21,22,23,24,25,26. Por lo general, los VE bacterianos (bEV) contienen un subconjunto de sus componentes celulares, incluidas algunas porciones de ácidos nucleicos, lípidos y cientos de metabolitos y proteínas^27,28. A diferencia de los liposomas en los que unas pocas proteínas purificadas se cargan artificialmente, los bEV contienen cientos de proteínas cargadas de forma natural y plegadas de forma nativa con una mejor propensión a preparar el sistema inmunitario, especialmente sin el refuerzo/ayuda de adyuvantes y agonistas del receptor tipo Toll (TLR)^27,28,29. Es en esta línea de investigación que nosotros y otros hemos explorado la utilidad de los VE micobacterianos como posibles potenciadores de subunidades para BCG³⁰. A pesar de la preocupación de que los BVE carezcan de cargas antigénicas uniformes, los VE de Neisseria meningitidis atenuada han protegido con éxito a los seres humanos contra el meningococo del serogrupo B^31,32.

Al menos teóricamente, los mejores VE que podrían impulsar bien la BCG son los VE enriquecidos a partir de bacterias patógenas. Sin embargo, el enriquecimiento de los VE generados por micobacterias patógenas es costoso, requiere mucho tiempo y es arriesgado. Además, los vehículos eléctricos generados por patógenos pueden ser más virulentos que protectores. Dados los riesgos potenciales, aquí informamos de un protocolo bien probado para el enriquecimiento de los VE generados por Msm, una micobacteria avirulenta cultivada axénicamente.

Sin embargo, a pesar de codificar varios ortólogos de proteínas patógenas, las micobacterias avirulentas carecen de varios antígenos vacunales/epítopos de proteínas patógenas necesarios para preparar suficientemente al sistema inmunitario hacia la protección³³. Por lo tanto, también exploramos la construcción y el enriquecimiento de EV recombinantes de Msm a través de la ingeniería molecular, de modo que una parte significativa de cualquier proteína patógena de interés expresada y traducida en Msm, debe llegar a sus EV. Planteamos la hipótesis de que una o más de las 10 proteínas más abundantes de los EV de MSM, cuando se fusionan con la proteína de interés, ayudarán en dicha translocación.

Cuando estábamos empezando a estandarizar el enriquecimiento de las VE micobacterianas (mEVs) en nuestro laboratorio, en 2011, Prados-Rosales et al. reportaron por primera vez la visualización y enriquecimiento de las mEVs in vitro³⁰. Más tarde, en 2014, el mismo grupo publicó una versión modificada de su método³⁴ de 2011. En 2015, Lee et al. también informaron de un método estandarizado de forma independiente para el enriquecimiento de mEV a partir de cultivos axénicos de micobacterias³⁵. Combinando ambos protocolos^34,35 e incorporando algunas de nuestras modificaciones después de una estandarización exhaustiva^, describimos aquí un protocolo que ayuda a enriquecer rutinariamente los mEV de cultivos axénicos de micobacterias ³⁶.

Aquí, detallamos particularmente el enriquecimiento de los VE específicos de Msm, que es una extensión de un protocolo publicado³⁶ para el enriquecimiento de los VE micobacterianos en general. También detallamos cómo construir mEVs recombinantes (R-mEVs) que contienen la proteína mCherry (como un reportero fluorescente rojo) y EsxA (Esat-6)^37,38,39, un inmunógeno predominante y una potencial subunidad vaccinógena de Mycobacterium tuberculosis. El protocolo para enriquecer los R-mEVs sigue siendo idéntico al que hemos descrito para enriquecer los EVs nativos a partir de Msm.

Protocol

1. Condiciones de crecimiento de Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli y sus derivados MedioCaldo líquido Middlebrook 7H9Prepare una solución madre de Tween-80 al 20 % precalentando previamente el volumen requerido de agua bidestilada (ddw) en un vaso de precipitados de vidrio a ~ 45-50 oC en un microondas, agregue el volumen requerido de Tween-80 con un cilindro de medición apropiado y revuelva continuamente …

Representative Results

Utilizamos M. smegmatis (Msm) como micobacteria modelo para demostrar el enriquecimiento de mEVs nativos y recombinantes (R-mEVs). Este protocolo de enriquecimiento de mEVs resumido esquemáticamente (Figura 1) también funciona para el enriquecimiento de R-mEVs de Msm y EVs nativos de Mtb (con modificaciones menores como en las notas de protocolo de 1.2). La visualización de los mEV enriquecidos requiere teñirlos negativamente bajo un microscopio electrónico de transmisión<sup …

Discussion

Dado que el desarrollo de una nueva vacuna contra la tuberculosis que sea superior a la BCG y que pueda sustituirla sigue siendo un reto formidable, como alternativa, varios grupos están buscando el descubrimiento de diferentes vacunas antituberculosas de subunidades que puedan aumentar la potencia de la BCG y prolongar su duración protectora^48,49. Dada la creciente atención a las VE bacterianas (bEV) como subunidades potenciales y como adyuvantes naturales<su…

Materials

A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155