عزل وثقافة وتوصيف الخلايا الليفية الجلدية الأولية من أنسجة الجدرة البشرية
Summary
تصف هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لإنشاء الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجدرة التي يمكن أن توفر خلايا ليفية نقية وقابلة للحياة بشكل فعال ومطرد.
Abstract
تلعب الخلايا الليفية، وهي نوع الخلية الرئيسي في أنسجة الجدرة، دورا أساسيا في تكوين الجدرة وتطورها. إن عزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية المشتقة من أنسجة الجدرة هي الأساس لمزيد من الدراسات حول الوظيفة البيولوجية والآليات الجزيئية للجدرة ، بالإضافة إلى استراتيجيات علاجية جديدة لعلاجها. الطريقة التقليدية للحصول على الخلايا الليفية الأولية لها قيود ، مثل الحالة الخلوية السيئة ، والاختلاط مع أنواع أخرى من الخلايا ، والتعرض للتلوث. تصف هذه الورقة بروتوكولا محسنا وقابلا للتكرار بسهولة يمكن أن يقلل من حدوث المشكلات المحتملة عند الحصول على الخلايا الليفية. في هذا البروتوكول ، يمكن ملاحظة الخلايا الليفية بعد 5 أيام من العزلة وتصل إلى ما يقرب من 80٪ التقاء بعد 10 أيام من الثقافة. بعد ذلك ، يتم تمرير الخلايا الليفية والتحقق منها باستخدام الأجسام المضادة PDGFRα و vimentin لمقايسات التألق المناعي والأجسام المضادة CD90 لقياس التدفق الخلوي. في الختام ، يمكن الحصول بسهولة على الخلايا الليفية من أنسجة الجدرة من خلال هذا البروتوكول ، والذي يمكن أن يوفر مصدرا وفيرا ومستقرا للخلايا في المختبر لأبحاث الجدرة.
Introduction
الجدرة ، وهو مرض تكاثري ليفي ، يتجلى في النمو المستمر للويحات التي غالبا ما تغزو الجلد الطبيعي المحيط دون قيود ذاتية وتسبب درجات مختلفة من الحكة والألم والأعباء التجميلية والنفسية للمرضى1. تلعب الخلايا الليفية ، وهي الخلايا الأولية المشاركة في الجدرة ، دورا أساسيا في تكوين هذا المرض وتطوره من خلال الانتشار المفرط ، وإنتاج المصفوفة الزائدة خارج الخلية ، والكولاجين غير المنظم2،3. ومع ذلك ، لا يزال التسبب في المرض الأساسي غير واضح ، ولا تزال هناك طريقة علاجية فعالة للجدرة ؛ لذلك ، هناك حاجة ملحة لمزيد من البحث 4,5.
نظرا لعدم وجود نموذج حيواني مثالي لأبحاث الجدرة في الجسم الحي 6،7 ، فإن بناء نموذج في المختبر عن طريق الحصول على الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجدرة يمكن أن يوفر جدوى وموثوقية لأبحاث الجدرة 2,6. الخلايا الأولية هي تلك المشتقة مباشرة من الأنسجة الحية ، ومن المسلم به عموما أن هذه الخلايا يمكن أن تشبه إلى حد كبير الحالة الفسيولوجية والخلفية الوراثية للعديد من الأفراد مقارنة بخطوط الخلايا 8,9. توفر زراعة الخلايا الأولية وسيلة قوية لدراسة نمو الخلايا واستقلابها ، بالإضافة إلى الأنماط الظاهرية الأخرى للخلايا.
في الوقت الحاضر ، هناك طريقتان للحصول على الخلايا الليفية الأولية: هضم الإنزيم وثقافة الزرع. ومع ذلك ، فقد تم تحديد العديد من العقبات التي تحول دون الحصول على الخلايا الليفية الأولية ، مثل خطر التلوث بالبكتيريا أو الفطريات المختلفة ، والاختلاط مع أنواع أخرى من الخلايا التي لا يمكن إزالتها بسهولة ، والفترة الطويلة لدورة الاستزراع ، والتغييرات اللاحقة في خصائص الخلية مقارنة بالخلايا الأصلية ، وما إلى ذلك9. لذلك ، فإن تطوير عملية مجدية وفعالة للحصول على الخلايا الليفية الأولية هو الأساس لمزيد من الدراسات والتطبيقات. تصف هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لاستخراج الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجدرة التي يمكن أن توفر خلايا ليفية نقية وقابلة للحياة بشكل فعال ومطرد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد الحصول على الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجدرة أساسا حاسما لمزيد من البحث. حتى الآن ، كانت هناك طريقتان للحصول على الخلايا الليفية الأولية: هضم الإنزيم وزراعةالنباتات 11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن كلتا الطريقتين التق?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنح 81903189 و 82073418) ومؤسسة العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (رقم المنحة 202102020025).
Materials
| 1.5 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| 15 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% polyformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | Cell fixation |
| 50 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8081 | Put keloid tissue |
| Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG | Abcam | Alexa Fluor 555 | second antibody for immunofluorescence staining assay |
| Anti human CD90 | BioLegend | B301002 | Identify the purity of fibroblasts |
| Antibody diluent | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 series A2 | Isolation and culture cells |
| Bovine serum albumin | aladdin | B265993 | Blocking for immunofluorescence staining assay |
| Carbon dioxide incubator | ESCO | CCL-170B-8 | Using for culturing cells |
| Cell cryotubes | Corning | 43513 | Store the cells in low temperature |
| centrifugal machine | Thermo Fisher | ST 16R | Discard supernatant |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | Stain the cellular nucleus |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Using for preserving cells |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | C11995500BT | Culture medium solution |
| Fetal bovine serum | BI | 04-001-1A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCelesta | Observing the identity of cells |
| frozen box | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Laser confocal microscope | Nikon | AIR-HD25 | Observing the immunofluorescence staining assay |
| PDGFR-α antibody | CST | 3174T | First antibody for immunofluorescence staining assay |
| Penicillin-streptomycin-Am solution | Solarbio | P1410 | Add in culture medium solution to avoid contamination |
| petri dish | JETBIOFIL | 7556 | Culture fibroblasts |
| Phosphate buffered saline solution | Gibco | C10010500BT | Culture medium solution |
| Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE) | Cell Signaling Technology | 5742S | As a control for flow cytometry |
| Round coverslip | Biosharp | 801007 | Cell culture |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Punch holes in the cell membrane |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Used for passaging cells |
| Vimentin antibody | Abcam | ab8978 | First antibody for immunofluorescence staining assay |
Referências
- Zhu, Y. Q., et al. Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes. Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883 (2022).
- Feng, F., et al. Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 13, 906212 (2022).
- Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).
- Wang, W., et al. Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid. Frontiers in Medicine. 9, 1043840 (2022).
- Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic. British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).
- Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models. Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).
- Supp, D. M. Animal models for studies of keloid scarring. Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).
- Künzel, S. R., et al. Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59858 (2019).
- He, Y., et al. An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics. Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).
- Philippeos, C., et al. Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
- Li, L., et al. Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition. Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733 (2022).
- Zhou, B. Y., et al. Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).
- Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway. Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).
- Sato, C., et al. Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).
- Li, J., et al. Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts. Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).
- Wang, Q., et al. Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia. Redox Biology. 38, 101815 (2021).
- Fan, C., et al. Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts. Frontiers in Genetics. 13, 798331 (2022).
- Yao, L., et al. Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing. Cell Reports. 40 (7), 111192 (2022).
- Domdey, M., et al. Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium. Stem Cell Research. 40, 102936 (2022).
- Lin, Z., et al. Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease. FASEB Journal. 36 (12), e22625 (2022).
- Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).
