İnsan Keloid Dokusundan Primer Dermal Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu
Summary
Bu çalışma, etkili ve istikrarlı bir şekilde saf ve canlı fibroblastlar sağlayabilen keloid dokulardan primer fibroblastlar oluşturmak için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır.
Abstract
Keloid dokudaki ana hücre tipi olan fibroblastlar, keloidlerin oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynar. Keloid dokusundan türetilen primer fibroblastların izolasyonu ve kültürü, keloidlerin biyolojik fonksiyonu ve moleküler mekanizmalarının yanı sıra bunları tedavi etmek için yeni terapötik stratejiler hakkında daha ileri çalışmaların temelini oluşturur. Primer fibroblastları elde etmenin geleneksel yöntemi, zayıf hücresel durum, diğer hücre tipleriyle karışma ve kontaminasyona yatkınlık gibi sınırlamalara sahiptir. Bu makale, fibroblast elde edilirken olası sorunların ortaya çıkmasını azaltabilecek optimize edilmiş ve kolayca tekrarlanabilir bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokolde fibroblastlar izolasyondan 5 gün sonra gözlenebilmekte ve 10 günlük kültürden sonra %80’e yakın birleşmeye ulaşabilmektedir. Daha sonra fibroblastlar, immünofloresan testleri için PDGFRa ve vimentin antikorları ve akış sitometrisi için CD90 antikorları kullanılarak pasajlanır ve doğrulanır. Sonuç olarak, keloid dokusundan fibroblastlar, keloid araştırmaları için laboratuvarda bol ve stabil bir hücre kaynağı sağlayabilen bu protokol aracılığıyla kolayca elde edilebilir.
Introduction
Fibroproliferatif bir hastalık olan keloid, genellikle çevredeki normal cildi kendi kendini sınırlamadan istila eden ve hastalar için çeşitli derecelerde kaşıntı, ağrı ve kozmetik ve psikolojik yüklere neden olan plakların sürekli büyümesi olarak kendini gösterir1. Keloidlerde yer alan birincil hücreler olan fibroblastlar, aşırı proliferasyon, gereksiz hücre dışı matriks üretimi ve düzensiz kollajenler yoluyla bu hastalığın oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynar 2,3. Bununla birlikte, altta yatan patogenez belirsizliğini korumaktadır ve keloid için etkili bir terapötik yöntem hala eksiktir; Bu nedenle, daha fazla araştırmaya acil ihtiyaç vardır 4,5.
İn vivo keloid araştırmaları için ideal bir hayvan modeli olmadığından, keloid dokulardan primer fibroblastlar elde ederek bir in vitro model oluşturmak, keloid araştırmaları için fizibilite ve güvenilirlik sağlayabilir 2,6. Birincil hücreler, doğrudan canlı dokudan türetilen hücrelerdir ve genel olarak bu hücrelerin, hücre dizilerine kıyasla birden fazla bireyin fizyolojik durumuna ve genetik arka planına daha yakından benzeyebileceği kabul edilmektedir 8,9. Birincil hücrelerin kültürlenmesi, hücrelerin büyümesini ve metabolizmasını ve diğer hücre fenotiplerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.
Şu anda, primer fibroblastları elde etmek için iki yöntem vardır: enzim sindirimi ve eksplant kültürü. Bununla birlikte, primer fibroblastların elde edilmesinde, çeşitli bakteri veya mantarlar tarafından kontaminasyon riski, kolayca çıkarılamayan diğer hücre türleri ile karışma, kültür döngüsünün uzun süresi, orijinal hücrelere kıyasla hücre özelliklerinde müteakip değişiklikler vb. gibi çeşitli engeller tanımlanmıştır 9. Bu nedenle, primer fibroblastların elde edilmesi için uygulanabilir ve etkili bir süreç geliştirmek, daha ileri çalışmalar ve uygulamalar için temel oluşturur. Bu çalışma, saf ve canlı fibroblastları etkili ve istikrarlı bir şekilde sağlayabilen keloid dokulardan primer fibroblastların çıkarılması için optimize edilmiş bir protokolü tanımlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Keloid dokulardan primer fibroblastların elde edilmesi, daha ileri araştırmalar için kritik bir temeldir. Şimdiye kadar, primer fibroblastları elde etmek için iki yöntem vardı: enzim sindirimi ve eksplant kültürü11,12,13,14. Bununla birlikte, her iki geleneksel yöntemin de kontaminasyona yatkınlık, diğer hücre tipleriyle karışma, uzun bir kültür süresi ve düşük başarı…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81903189 ve 82073418 numaralı hibeler) ve Guangzhou Bilim ve Teknoloji Vakfı’ndan (202102020025 numaralı hibe) alınan hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 1.5 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| 15 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% polyformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | Cell fixation |
| 50 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8081 | Put keloid tissue |
| Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG | Abcam | Alexa Fluor 555 | second antibody for immunofluorescence staining assay |
| Anti human CD90 | BioLegend | B301002 | Identify the purity of fibroblasts |
| Antibody diluent | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 series A2 | Isolation and culture cells |
| Bovine serum albumin | aladdin | B265993 | Blocking for immunofluorescence staining assay |
| Carbon dioxide incubator | ESCO | CCL-170B-8 | Using for culturing cells |
| Cell cryotubes | Corning | 43513 | Store the cells in low temperature |
| centrifugal machine | Thermo Fisher | ST 16R | Discard supernatant |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | Stain the cellular nucleus |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Using for preserving cells |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | C11995500BT | Culture medium solution |
| Fetal bovine serum | BI | 04-001-1A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCelesta | Observing the identity of cells |
| frozen box | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Laser confocal microscope | Nikon | AIR-HD25 | Observing the immunofluorescence staining assay |
| PDGFR-α antibody | CST | 3174T | First antibody for immunofluorescence staining assay |
| Penicillin-streptomycin-Am solution | Solarbio | P1410 | Add in culture medium solution to avoid contamination |
| petri dish | JETBIOFIL | 7556 | Culture fibroblasts |
| Phosphate buffered saline solution | Gibco | C10010500BT | Culture medium solution |
| Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE) | Cell Signaling Technology | 5742S | As a control for flow cytometry |
| Round coverslip | Biosharp | 801007 | Cell culture |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Punch holes in the cell membrane |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Used for passaging cells |
| Vimentin antibody | Abcam | ab8978 | First antibody for immunofluorescence staining assay |
Referências
- Zhu, Y. Q., et al. Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes. Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883 (2022).
- Feng, F., et al. Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 13, 906212 (2022).
- Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).
- Wang, W., et al. Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid. Frontiers in Medicine. 9, 1043840 (2022).
- Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic. British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).
- Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models. Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).
- Supp, D. M. Animal models for studies of keloid scarring. Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).
- Künzel, S. R., et al. Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59858 (2019).
- He, Y., et al. An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics. Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).
- Philippeos, C., et al. Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
- Li, L., et al. Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition. Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733 (2022).
- Zhou, B. Y., et al. Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).
- Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway. Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).
- Sato, C., et al. Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).
- Li, J., et al. Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts. Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).
- Wang, Q., et al. Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia. Redox Biology. 38, 101815 (2021).
- Fan, C., et al. Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts. Frontiers in Genetics. 13, 798331 (2022).
- Yao, L., et al. Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing. Cell Reports. 40 (7), 111192 (2022).
- Domdey, M., et al. Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium. Stem Cell Research. 40, 102936 (2022).
- Lin, Z., et al. Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease. FASEB Journal. 36 (12), e22625 (2022).
- Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).
