Summary
Deze studie beschrijft de stappen voor het verkrijgen van beelden met een hoge resolutie van neonatale muizenhersenen door micro-computertomografie (micro-CT) en een contrastmiddel te combineren in ex vivo monsters. We beschrijven basis morfometrische analyses om de grootte en vorm van de hersenen in deze beelden te kwantificeren.
Abstract
Neurobeelden zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van hersenmorfologie in experimenten met diermodellen. Magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) is de standaardmethode geworden voor zachte weefsels, hoewel de lage ruimtelijke resolutie enkele beperkingen met zich meebrengt voor kleine dieren. Hier beschrijven we een protocol voor het verkrijgen van driedimensionale (3D) informatie met hoge resolutie over de hersenen en schedels van pasgeborenen van muizen met behulp van micro-computertomografie (micro-CT). Het protocol omvat de stappen die nodig zijn om de monsters te ontleden, de hersenen te kleuren en te scannen, en morfometrische metingen van het hele orgaan en de interessegebieden (ROI's) te verkrijgen. Beeldanalyse omvat de segmentatie van structuren en de digitalisering van puntcoördinaten. Kortom, dit werk laat zien dat de combinatie van micro-CT en Lugol's oplossing als contrastmiddel een geschikt alternatief is voor het in beeld brengen van de perinatale hersenen van kleine dieren. Deze beeldvormingsworkflow heeft toepassingen in de ontwikkelingsbiologie, biogeneeskunde en andere wetenschappen die geïnteresseerd zijn in het beoordelen van het effect van verschillende genetische en omgevingsfactoren op de ontwikkeling van de hersenen.
Introduction
Micro-computertomografie (micro-CT) beeldvorming is een waardevol hulpmiddel voor verschillende onderzoeksgebieden. In de biologie is het vooral geschikt voor botonderzoek vanwege de absorptie van röntgenstraling in gemineraliseerde weefsels. Vanwege deze functie zijn diverse vragen over onder andere botontwikkeling1, metabolisme2 en evolutie 3,4 benaderd met behulp van micro-CT. In 2008 toonden de Crespigny et al.5 aan dat micro-CT-beelden van volwassen muizen- en konijnenhersenen konden worden verkregen met jodium als contrastmiddel. Dit werk opende een nieuwe toepassing voor deze beeldvormingstechniek, aangezien jodium het mogelijk maakte beelden te verkrijgen van zachte weefsels die anders ongevoelig zouden zijn voor röntgenstralen. Het algemene doel van het combineren van micro-CT en een contrastmiddel op basis van jodium is dus het verkrijgen van beelden met een hoge resolutie, waarin zachte weefsels kunnen worden onderscheiden en geïdentificeerd op meso- of macro-anatomisch niveau.
Deze techniek heeft een opmerkelijk potentieel voor studies die gedetailleerde ex vivo fenotypische karakterisering vereisen van kleine exemplaren, zoals muizenembryo's, die veel worden gebruikt in experimentele ontwerpen6. Jodiumcontrast in combinatie met micro-CT-beeldvorming is gebruikt om volumetrische kwantificeringen van organen7 en historische driedimensionale (3D) structuren te verkrijgen 8,9. In de afgelopen jaren is micro-CT-scanning van gekleurde monsters toegepast om fenotypische kenmerken van knaagdieren in de hersenen te beschrijven10, en er zijn verschillende verbeteringen aan de techniek voorgesteld. Voor volwassen hersenen bleek een protocol van 48 uur onderdompeling in jodium, met een voorafgaande stap van perfusie met een hydrogel, beelden van hoge kwaliteit te produceren11. Gignac et al.12 verlegden de grenzen van deze techniek door aan te tonen dat rattenhersenen die met jodium waren gekleurd, konden worden verwerkt om routinematige histologische technieken uit te voeren. Evenzo laten deze procedures veelbelovende resultaten zien voor embryonale en pre-spenende knaagdierhersenen 8,13,14,15.
Hoewel de neurowetenschap grotendeels op microscoop gebaseerde technieken heeft toegepast om verschillende structurele en functionele aspecten van de ontwikkeling van de hersenen te beoordelen, zijn dergelijke studies geschikter voor het karakteriseren van specifieke celpopulaties of ruimtelijk beperkte structuren. Omgekeerd maakt micro-CT-beeldvorming het mogelijk om hele structuren te beschrijven en 3D-modellen te verwerven die relevante ruimtelijke informatie bewaren, wat complementair is aan microscopische technieken. Magnetic Resonance Imaging (MRI) is ook een standaardtechniek die wordt toegepast om de structurele kenmerken van kleine dieren te onderzoeken 16,17,18. Micro-CT, met het gebruik van een contrastmiddel, heeft echter twee belangrijke voordelen voor ex vivo vaste monsters: micro-CT-scanners zijn veel goedkoper en eenvoudig te bedienen, en maken een hogere ruimtelijke resolutie mogelijk dan MRI12.
Dit werk heeft tot doel de procedure te beschrijven om beelden met een hoge resolutie te verkrijgen van neonatale muizenhersenen met behulp van micro-CT-scanning na kleuring met de oplossing van Lugol, een contrastmiddel op basis van jodium. Er wordt een uitgebreid protocol gepresenteerd, dat begint met voorbereidende fasen zoals monsterverzameling en fixatie van weefsels, en gaat door kleuring, micro-CT-beeldacquisitie en standaardverwerking. Beeldverwerking omvat de segmentatie van een 3D-volume van het volledige hoofd, evenals van de hersenen, en de selectie van specifieke anatomische vlakken om puntcoördinaten te digitaliseren die vervolgens kunnen worden gebruikt in morfometrische analyses. Hoewel de focus hier ligt op het neonatale muizenbrein, kunnen vergelijkbare strategieën worden toegepast op andere zachte weefsels. Het hier gepresenteerde protocol is dus flexibel genoeg om, met subtiele aanpassingen, te worden toegepast op andere soorten monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures volgden de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care.
1. Monstername en -voorbereiding
- Bereid 500 ml 4% paraformaldehyde (PFA) voor.
- Voeg onder een extractieflux in een kast 20 g PFA-poeder toe aan 250 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een glazen bekerglas van 1 liter. Plaats het bekerglas met een magneet op een magnetisch roerplaatje.
- Roer tijdens het verwarmen. Controleer met een thermometer constant de temperatuur van de oplossing om deze onder de 60 °C te houden.
- Voeg met een plastic pasteurpipet druppels van 1 M NaOH toe aan de oplossing om de PFA op te lossen. Zodra het PFA-poeder volledig is opgelost, koelt u de oplossing af bij kamertemperatuur (RT).
- Stel het volume in op 500 ml met 1x PBS. Pas de pH aan naar 7,2-7,3 door druppels van 1 M HCl toe te voegen met een plastic pasteurpipet.
- Filtreer de oplossing met behulp van een papieren filter en een glazen trechter in een glazen fles van 1 liter.
- Sluit de glazen fles, haal deze uit de fluxkast en bewaar in de koelkast bij -4 °C.
- Verzamel hersenmonsters.
- Om monsters te verkrijgen, offermuizen pasgeborenen de ochtend na hun geboorte, op een leeftijd van 0,5 dag (P 0,5), met behulp van een chirurgische schaar om ze te onthoofden.
- Plaats de schaar in de nek van de pasgeborene terwijl u het lichaam vasthoudt en voer een enkele en zuivere snede uit.
- Fixeer de monsters in PFA.
- Vul een conische buis van 50 ml met 40 ml 4% PFA.
- Dompel elke kop onder in de buis die PFA als fixatiemiddel bevat. Gebruik hiervoor een Paton-spatel of een lepel.
- Bewaar de conische buisjes 48 uur in de koelkast bij -4 °C en verander ze daarna in 40 ml 1x PBS met 0,1% natriumazide als conserveermiddel. Gekoeld bewaren bij -4 °C.
2. Monster kleuring
- Bereid de oplossing van Lugol (3,75% m/v).
- Los onder een extractieflux in een kast, in een glazen bekerglas van 1 liter, 10 g Kl en 5 g I2 op 400 ml gedestilleerd water op, onder constante menging met behulp van een magnetische roerder.
- Dompel elke kop onder in een conische buis van 50 ml met 40 ml Lugol-oplossing.
- Voor pasgeborenen met een geschatte lichaamsgrootte van 1,3 g, laat de monsters 15-20 uur ondergedompeld en meng ze constant met behulp van een orbitale shaker.
- Plaats de monsters gedurende 30 minuten in een conische buis van 15 ml met 10 ml 1% agarose voordat u gaat scannen.
3. Micro-CT-scannen
OPMERKING: Micro-CT-scanning vereist specifieke apparatuur. Er zijn verschillende opties voor dit soort scanners en details over de aanschaf zijn afhankelijk van de kenmerken van de gebruikte apparatuur. Het laboratorium van Dr. Hallgrímsson rekent op enkele alternatieven voor micro-CT-scanners. Hier is het protocol gebaseerd op het gebruik van een eenvoudige desktopscanner, een van de meer toegankelijke beeldvormingsmachines voor kleine dieren die door laboratoria over de hele wereld worden gebruikt. Als het scandoel de schedel is, sla dan de stappen in sectie 2 van het protocol over en ga verder met sectie 3. Na het scannen van de schedel kon het kleuringsproces en het scannen van de hersenen worden uitgevoerd om beelden te verkrijgen van dezelfde monsters van zowel de hersenen als de schedel.
- Plaats het monster in de micro-CT-houder.
- Plaats het monster in een conische buis van 50 ml. Fixeer het monster om bewegingen tijdens de scannersessie te voorkomen. Voor dit doel kan wat polyurethaanmateriaal worden gebruikt om de lege delen van de buis te vullen.
- Open de apparatuur en plaats het buisje met het monster in de micro-CT-houder.
- Log in op het micro-CT controlepaneel en registreer het te scannen monster. Hierdoor wordt automatisch een voorbeeldnummer gegenereerd. Vul naast het nummer ook het veld "Naam" in. Zowel de naam als het nummer van de steekproef moeten elders worden vastgelegd (bijvoorbeeld in een spreadsheet) voor het geval de ruwe gegevens opnieuw moeten worden opgehaald.
- Start het scanprogramma. Voer de naam of het nummer van het monster in en selecteer een controlebestand , dat de scanparameters moet bevatten.
- Scan het monster.
- Stel in het scherm van de micro-CT-software de volgende parameters in: isotrope voxelgrootte van 0,012 mm, 45 kVp, 177 lA, 800.000 ms integratietijd en 500 projecties per 180°.
- Stel het scangebied in door Scout View te selecteren. Zodra de referentieafbeelding verschijnt, drukt u op Referentielijn om de regio in te stellen. Verplaats de ononderbroken groene lijn naar de rand van het monster en houd Shift ingedrukt terwijl u de cursor sleept om het scangebied uit te breiden naar de andere rand van het monster.
- Selecteer OK om de scan te starten.
- Evalueer en exporteer de scan.
- Open het evaluatieprogramma van de micro-CT-scanner en klik op Monster en meting selecteren. Typ in het veld Filter de naam van het monster, selecteer het monster en selecteer het meetbestand.
- Het bestand wordt geladen als segmenten, waarvan het aantal afhankelijk is van het eerste scanvenster. Klik op de knop Alles laden , waardoor elk plakje wordt geladen en later de verplaatsing tussen plakjes wordt vergemakkelijkt.
- Selecteer Taken > Evaluatie 3D om een bijsnijdvak rond de segmenten te initialiseren. Er verschijnt een 3D-evaluatieprompt met een aantal velden, waaronder Taak/Evaluatie, VOI (Volume of Interest), Start X, Y, Z en Dimensie X, Y, Z.
- Stel het veld Taak > evaluatie 3D in op het juiste script, aangezien verschillende evaluatietaken kunnen worden uitgevoerd, zoals reconstructie, segmentatie, morfometrie (bijv. botmineraaldichtheid) en bestandsconversies of -overdrachten. Het standaardevaluatiescript kan als richtlijn worden gebruikt.
- Nadat u het script hebt geselecteerd, past u het VOI-vak op de hoofdafbeelding aan. Begin met de eerste plak. Zorg ervoor dat de doos de te evalueren anatomie bevat. Verplaats de VOI door met de rechtermuisknop op een van de kleine witte vierkantjes in de richting van de rand van het vak te klikken en het formaat van de VOI te wijzigen met de middelste muisknop. U kunt ook de dimensievelden numeriek aanpassen.
- Ga door het monster met behulp van de schuifbalk onder de afbeelding om er zeker van te zijn dat alle anatomieën zijn vastgelegd in de VOI-box. Klik op XY, XZ of YZ in de linkerbovenhoek van de software om de oriëntatie te wijzigen.
- Selecteer Evaluatie starten. Afhankelijk van het script voor taakevaluatie wordt hiermee een 3D .aim-afbeeldingsbestand gegenereerd met een bijbehorend .txt-headerbestand. Bovendien kan in het script een pad worden opgegeven om de afbeelding naar een bepaalde locatie te verplaatsen met File Transfer Protocol (FTP).
4. Beeldverwerking
- Open de afbeeldingen in de beeldverwerkingssoftware.
OPMERKING: Beeldverwerking kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende software. Dit protocol omvat de basisstappen in commerciële software, die algemeen wordt geaccepteerd in het gebied en veelzijdige tools heeft voor basis- en geavanceerde verwerking. Daarnaast zijn er verschillende acceptabele formaten voor gereconstrueerde micro-CT-beelden. Dit aspect hangt meestal af van de apparatuur die wordt gebruikt voor acquisitie en de software ervan. Hier wordt beeldverwerking uitgevoerd met .bmp beelden. Dezelfde procedure kan worden toegepast voor .tiff afbeeldingen en andere typen. Aangezien de acquisitie wordt uitgevoerd in een scanner met .aim als standaardformaat, wordt eerst een conversie van .aim naar .bmp gepresenteerd.- Als u AIM-bestanden wilt openen, selecteert u Bestand > Open Data en kiest u het bestand. Daarna wordt een venster geopend met de titel Selectie bestandsindeling. Selecteer Ruwe gegevens.
- Er wordt een venster geopend met de titel Raw Data Parameters. Vul in dit venster de parameters in volgens de informatie in de koptekst .txt bestand dat voor elk .aim-bestand wordt gegenereerd. Kies bij Gegevenstype 16-bits voor koptekst, compleet met het nummer nadat Afbeeldingsgegevens beginnen bij byte-offset. Stel ook de afmetingen en voxelgrootte in met behulp van de informatie in de koptekst .txt bestand. Zodra de parameters zijn voltooid, drukt u op OK.
- Als conversie van .aim naar .bmp nodig is, klikt u in het hoofdpaneel > de projectweergave met de rechtermuisknop op het .aim-object en selecteert u de optie Converteren > Afbeeldingstype converteren. Selecteer bij Eigenschappen 8-bits als uitvoertype. Selecteer Toepassen.
- Klik met de rechtermuisknop op het nieuwe 8-bits object. Selecteer Opslaan als. Kies .bmp en sla op.
- Als u het .bmp bestand wilt openen, selecteert u Bestand > Gegevens openen en kiest u het bestand. Daarna wordt een venster met de parameters van de afbeelding geopend. Bevestig de parameters en accepteer indien correct.
- In het hoofdpaneel > de projectweergave wordt een nieuw object gemaakt met de naam van de .bmp bestanden. Klik met de rechtermuisknop op dit object en selecteer de optie Ortho Slice. Selecteer in Eigenschappen het segmentnummer en het oriëntatievlak dat u wilt zien.
- Verkrijg 3D-volumes van het volledige hoofd.
- Klik in het hoofdpaneel > de projectweergave met de rechtermuisknop op het afbeeldingsobject. Selecteer de optie Interactieve drempels > Maken. Wijzig in Eigenschappen de waarden voor Minimale RGB en Maximale RGB totdat het deel van de afbeelding dat overeenkomt met de kop van het dier is geselecteerd. Selecteer Toepassen.
- In het hoofdpaneel > de projectweergave wordt een object met drempelwaarde gemaakt. Klik met de rechtermuisknop op dit object en selecteer in Eigenschappen Isosurface. Kies in Eigenschappen een drempel om het oppervlak te visualiseren en klik op Toepassen. Deze drempel moet empirisch worden gekozen, waarna mogelijk verschillende waarden moeten worden onderzocht.
- Puntcoördinaten digitaliseren
- 3D-puntcoördinaten kunnen worden gedigitaliseerd, zowel op basis van plakjes als op geëxtraheerde oppervlakken. Voor de eerste optie klikt u met de rechtermuisknop in de afbeeldingsoptie en selecteert u Segment. Kies in Vertalen het gewenste segment in het axiale vlak. Als het vlak niet correct is geplaatst, klikt u op Opties > Roteren in Eigenschappen om de juiste afdrukstand vast te stellen.
- Als u oriëntatiepunten wilt digitaliseren, klikt u met de rechtermuisknop in het hoofdpaneel > de projectweergave en selecteert u Object > punten en lijnen > oriëntatiepunten maken. Klik met de rechtermuisknop op de nieuwe objectoriëntatiepunten en selecteer Oriëntatiepuntweergave. Wijzig in de oriëntatiepuntweergave de grootte van het punt in Grootte. Om oriëntatiepunten toe te voegen in Eigenschappen, gebruikt u de optie Toevoegen in de bewerkingsmodus.
OPMERKING: Voor pasgeborenen werd eerder een reeks oriëntatiepunten en semi-oriëntatiepunten rond de axiale en sagittale krommen van de hersenen gepubliceerd14. - Kies eerst het axiale vlak dat het meest rostrale punt van de bulbus olfactorius en het meest caudale punt van de cortex kruist.
- Selecteer de Objectoriëntatiepunten en selecteer in Eigenschappen Oriëntatiepunteditor. Klik met de pijl op de plaats waar het punt gedigitaliseerd moet worden.
- In de voorgestelde set oriëntatiepunten worden 24 punten gedigitaliseerd in het geselecteerde axiale vlak. Digitaliseer de eerste in het meest caudale punt van de hersenen bij de middellijn.
- Digitaliseer vijf punten gelijkmatig verdeeld over de curve (semi-oriëntatiepunten) tot het volgende oriëntatiepunt op het snijpunt tussen de middenhersenen en de cortex.
- Digitaliseer vervolgens acht punten (semi-oriëntatiepunten) rond de cortex.
- Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen de cortex en de bulbus olfactorius. Digitaliseer vervolgens vier punten (semi-oriëntatiepunten) rond de bulbus olfactorius.
- Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op het meest rostrale punt van de reukbollen op de middellijn. Digitaliseer vervolgens twee punten (semi-oriëntatiepunten) tussen beide bulbus olfactorius.
- Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op het meest caudale punt van de bulbus olfactorius op de middellijn.
- Voor sagittale punten maakt u een plak in de rechterkant van de hersenen op een parasagittaal vlak waar de hersenen het meest caudaal prominent aanwezig zijn.
- In de voorgestelde set oriëntatiepunten worden 33 punten gedigitaliseerd in het geselecteerde parasagittale vlak. Digitaliseer de eerste in de kruising tussen het diencephalon en de achterhersenen. Digitaliseer vervolgens negen punten (semi-oriëntatiepunten) in de ventrale limiet van de hersenen.
- Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op het meest rostrale punt van de bulbus olfactorius. Digitaliseer vervolgens drie punten (semi-oriëntatiepunten) rond de bulbus olfactorius.
- Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen de bulbus olfactorius en de cortex. Digitaliseer vervolgens drie punten (semi-oriëntatiepunten) rond de bulbus olfactorius.
- Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen de bulbus olfactorius en de cortex. Digitaliseer vervolgens zeven punten (semi-oriëntatiepunten) rond de cortex.
- Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen de cortex en de middenhersenen. Digitaliseer vervolgens zeven punten (semi-oriëntatiepunten) rond de cortex.
- Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen de cortex en de middenhersenen. Digitaliseer vervolgens zes punten (semi-oriëntatiepunten) rond de middenhersenen.
- Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen de middenhersenen en het cerebellum. Digitaliseer vervolgens twee punten (semi-oriëntatiepunten) rond het cerebellum.
- Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen het cerebellum en de achterhersenen.
- Sla de gedigitaliseerde punten op. Klik met de rechtermuisknop op de Objectoriëntatiepunten en kies de optie Gegevens opslaan.
- Analyseer de puntcoördinaten.
OPMERKING: Zodra de puntcoördinaten zijn gedigitaliseerd voor een reeks preparaten, kunnen basisanalyses worden uitgevoerd met behulp van geometrische morfometrische hulpmiddelen om grootte- (zwaartepuntgrootte) en vormvariabelen (vorm of Procrustes-coördinaten) te verkrijgen. Analyses worden uitgevoerd in een gratis open software-omgeving, die vooral geschikt is voor statistische analyses.- Bouw met behulp van een notitieblok een bestand op met de coördinaten van alle gedigitaliseerde exemplaren. Volg hiervoor het TPS-formaat, zoals beschreven in https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm.
- Open de statistische software. Selecteer Bestand > Dir wijzigen om de map te kiezen waarin het tps-bestand is opgeslagen.
- Selecteer Pakketten > Pakketten installeren. Kies een Cran Mirror. Zoek naar geomorph en installeer deze.
- Laad pakketten door in de console te typen: bibliotheek (geomorf) en bibliotheek (Morpho).
- Laad de dataset door in de console te typen: dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID").
- Voer een gegeneraliseerde Procrustes-analyse uit door in de console te typen: GPA<- gpagen(dataset).
- Verkrijg de zwaartepuntgrootte door in de console te typen: CS<-GPA$Csize.
- Verkrijg Procrustes-coördinaten door in de console te typen: ProcCoord<- GPA$coords.
- Plot de Procrustes-coördinaten en de gemiddelde vorm door in de console te typen: plotAllSpecimens(ProcCoord).
- Segmentatie van ROI's
OPMERKING: Om de hersenen te segmenteren en een 3D-reconstructie te verkrijgen, identificeert u handmatig de hersenweefsels in elk plakje. Dezelfde procedure kan worden toegepast op specifieke ROI's, zoals de bulbus olfactorius, cortex, enz.- Klik met de rechtermuisknop op het hoofdpaneel > de projectweergave en selecteer Object maken > labelveld.
- Selecteer het object Labelveld en druk op de optie Segmentatie-editor in Eigenschappen.
- Voeg in Materialen een nieuw materiaal toe en hernoem het, indien gewenst, naar Hersenen.
- Kies in Selectie de optie Huidig segment om het weefsel dat overeenkomt met de hersenen in elk plakje te segmenteren.
- Selecteer met behulp van de opties in Tools het hersenweefsel in elk plakje. Voor dit geval zijn de Toverstaf en de Borstel het meest geschikt.
- Zodra de selectie in elk segment is gemaakt, drukt u op Selectie toevoegen.
- Wanneer de selectie in alle segmenten is voltooid, keert u terug naar de projectweergave in het hoofddeelvenster en klikt u met de rechtermuisknop op Labelveld om Surface genereren te selecteren en klikt u vervolgens op Toepassen.
- Zodra het oppervlak is verkregen, exporteert u het door Extract Surface aan te brengen.
- Als u het volume van de gesegmenteerde structuren wilt verkrijgen, selecteert u in het hoofdpaneel > de projectweergave het object dat het label bevat, klikt u met de rechtermuisknop en selecteert u Meten en analyseren > volumefractie. Klik vervolgens op Toepassen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier wordt een basisprotocol gepresenteerd om beelden met een hoge resolutie van neonatale muizenhersenen te verkrijgen. De hoofden werden gescand na onderdompeling in de oplossing van Lugol. Ondanks hun kleine formaat kunnen de belangrijkste anatomische structuren van de hersenen, zoals de bulbus olfactorius, de cortex, de middenhersenen, het cerebellum en de achterhersenen, worden onderscheiden (Figuur 1).
Aan de hand van deze beelden kunnen verschillende analyses worden uitgevoerd. Een reeks oriëntatiepunten en semi-oriëntatiepunten in twee verschillende anatomische vlakken werden gedigitaliseerd. Zoals te zien is in figuur 2, worden punten langs de hele grens van de hersenen op de gekozen vlakken geplaatst. Zodra de digitalisering is voltooid, kunnen de coördinaten van de punten worden gelezen in een .txt bestand (Figuur 3). Het doel van puntdigitalisering was om ruwe coördinaten te verkrijgen die verder kunnen worden gebruikt in geometrische morfometrische analyses. Het gepresenteerde protocol is gericht op een enkel monster en morfometrische analyses zijn geschikt voor grotere monsters, maar de resultaten die zijn verkregen met dezelfde reeks punten worden elders gepresenteerd14.
Ten slotte is het resultaat van handmatige segmentatie van het hele brein een 3D-model van het brein (Figuur 4). In deze volumes kunnen verschillende benaderingen worden gevolgd, van het eenvoudig schatten van hun oppervlakte en volume tot het extraheren van oppervlaktepunten, tot het uitvoeren van analyses die vergelijkbaar zijn met de analyse die hier wordt gepresenteerd voor curvepunten.
Figuur 1: Representatieve plakjes van een micro-CT-beeld van het hoofd van een pasgeborene. (A-C) Axiale, (D) coronale en (E) parasagittale vlakken worden gepresenteerd. Regio's en structuren die kunnen worden onderscheiden in het parasagittale vlak: (a) bulbus olfactorius, (b) cortex, (c) middenhersenen, (d) cerebellum, (e) achterhersenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Oriëntatiepunten en semi-oriëntatiepunten gedigitaliseerd in het voorgestelde protocol. (A) Axiale en (B) parasagittale vlakken worden gepresenteerd. Cijfers geven oriëntatiepunten aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeld van een bestand met puntcoördinaten zoals geëxporteerd uit de software. De belangrijkste punten worden aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: 3D-reconstructie van de hersenen van een pasgeborene na handmatige segmentatie. Een voorbeeld van een volledig gereconstrueerd brein wordt gepresenteerd in twee weergaven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit werk wordt een beknopt protocol geïntroduceerd om neonatale hersenweefsels van muizen te scannen met behulp van micro-CT met een contrastmiddel. Bovendien bevat het eenvoudige procedures om kwantitatieve en kwalitatieve output te verkrijgen. Voortbouwend op deze methoden kunnen verdere alternatieve of aanvullende analyses worden uitgevoerd.
Zoals in het protocol te zien is, kunnen micro-CT-beelden op verschillende manieren worden geanalyseerd. In eerdere studies schatte onze groep de grootte en vormvariatie in perinatale hersenen van muizen door coördinaten van punten te digitaliseren en geometrische morfometrische technieken toe te passen 8,14. De digitalisering van coördinaten is ook nuttig voor het verkrijgen van lineaire metingen, met behulp van een eenvoudige Euclidische afstandsschatting. Dit, samen met de volumes die zijn afgeleid van hersen- en ROI-segmentaties, zijn waardevolle input voor traditionele morfometrische beoordeling.
Hoewel het hier gepresenteerde protocol gemakkelijk kan worden toegepast op ex vivo kleine monsters, zoals degene die we hebben gebruikt, is het niet toepasbaar voor in vivo studies, omdat fixatie, en vooral de oplossing van Lugol als contrastmiddel, niet levensvatbaar is. Micro-CT-beeldvorming wordt in vivo gebruikt, meestal voor onderzoek van hardweefsel19, maar de toediening van contrastmiddelen die de hersenen bereiken en de hemato-encefalische barrière passeren bij levende pasgeborenen is niet eenvoudig. De hier gepresenteerde techniek is dus nog steeds een veelbelovend hulpmiddel om verschillende vragen over morfologische variatie te beantwoorden.
Aangezien baanbrekende studies hebben aangetoond dat jodium een goede keuze is voor embryo's van gewervelde dieren20, is de toepassing ervan snel uitgebreid en werd duidelijk dat een van de belangrijkste nadelen van deze techniek het krimpen is dat wordt geproduceerd door het contrastmiddel12. Het is een alomtegenwoordig probleem in onderzoeken die deze benadering gebruiken, en gebruikers moeten er rekening mee houden bij het reproduceren van het hier gepresenteerde protocol, aangezien er een zekere mate van krimp wordt verwacht. Er zijn verschillende strategieën voorgesteld om dit effect te verminderen; Vickerton et al.21 onderzochten verschillende concentraties jodium en concludeerden dat krimpen rechtstreeks afhangt van de concentratie, en dat het verminderen ervan grotendeels helpt om vervorming als gevolg van dit effect te beperken. Een ander punt dat moet worden aangepast, is de juiste tijd van onderdompeling, die afhangt van de grootte en de hardheid van de constructies. Na enkele tests ontdekten we dat 15-20 uur een voldoende periode is om de hersenweefsels van muizen te kleuren en de belangrijkste morfologische eigenschappen te behouden. Sommige auteurs hebben gesuggereerd om bepaalde oplossingen te gebruiken vóór het kleuren, zoals agarose7 en hydrogel11,13, of de toepassing van een gebufferde Lugol-oplossing die verzuring en bijgevolg krimp voorkomt22. Al deze procedures kunnen worden toegevoegd aan het hier gepresenteerde protocol, dat een algemene en basale benadering is van micro-CT-beeldvorming met jodiumcontrast.
Het gebruik van micro-CT-scanners voor het in beeld brengen van zachte weefsels in grotere monsters, zoals volwassen muizen, heeft enkele nadelen. Een onderdompelingsprocedure voor kleuring is niet aan te bevelen, omdat de verdeling van het contrastmiddel waarschijnlijk heterogeen zal zijn. Het zal belangrijk zijn om enkele alternatieve opties te onderzoeken, zoals het toedienen van de oplossing van Lugol via hartperfusie.
Concluderend is micro-CT met toevoeging van de oplossing van Lugol een geschikt alternatief voor het in beeld brengen van perinatale hersenen van kleine dieren, in het bijzonder muizen. Het is een eenvoudige manier om beelden met een hoge resolutie te verkrijgen die, aangevuld met histologie, een consistente karakterisering van de morfologische variatie van de hersenen kunnen bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken Wei Liu voor zijn technische assistentie. Dit werk wordt gefinancierd door ANPCyT PICT 2017-2497 en PICT 2018-4113.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
References
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660 (2021).
- Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
- Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
- de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227 (2016).
- Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
- Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Gignac, P. M., O'Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
- Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184 (2022).
- Turnbull, D. H., Mori, S.
- Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615 (2018).
- Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
- Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol's solution. Scientific Reports. 11, 19781 (2021).
