Summary
В этом исследовании описаны этапы получения изображений мозга новорожденных мышей с высоким разрешением путем сочетания микрокомпьютерной томографии (микро-КТ) и контрастного вещества в образцах ex vivo . Мы описываем основные морфометрические анализы для количественной оценки размера и формы мозга на этих изображениях.
Abstract
Нейроизображения являются ценным инструментом для изучения морфологии мозга в экспериментах на животных моделях. Магнитно-резонансная томография (МРТ) стала стандартным методом для мягких тканей, хотя ее низкое пространственное разрешение накладывает некоторые ограничения на мелких животных. В данной статье мы описываем протокол получения трехмерной (3D) информации высокого разрешения о мозге и черепе новорожденных мышей с помощью микрокомпьютерной томографии (микро-КТ). Протокол включает в себя шаги, необходимые для препарирования образцов, окрашивания и сканирования мозга, а также получения морфометрических измерений всего органа и областей интереса (ROI). Анализ изображений включает в себя сегментацию структур и оцифровку координат точек. В целом, эта работа показывает, что комбинация микро-КТ и раствора Люголя в качестве контрастного вещества является подходящей альтернативой для визуализации перинатального мозга мелких животных. Этот рабочий процесс визуализации находит применение в биологии развития, биомедицине и других науках, заинтересованных в оценке влияния различных генетических факторов и факторов окружающей среды на развитие мозга.
Introduction
Микрокомпьютерная томография (микро-КТ) является ценным инструментом для различных областей исследований. В биологии он особенно подходит для исследования костей из-за поглощения рентгеновских лучей в минерализованных тканях. Благодаря этой особенности различные вопросы, касающиеся развития костей1, метаболизма2 и эволюции 3,4, а также других тем, были решены с помощью микро-КТ. В 2008 году de Crespigny et al.5 показали, что микро-КТ-изображения мозга взрослых мышей и кроликов могут быть получены с использованием йода в качестве контрастного вещества. Эта работа открыла новое применение для этого метода визуализации, поскольку йод позволил получать изображения из мягких тканей, которые в противном случае были бы нечувствительны к рентгеновским лучам. Таким образом, общей целью совмещения микро-КТ и йодсодержащего контрастного вещества является получение изображений с высоким разрешением, на которых можно различить и идентифицировать мягкие ткани на мезо- или макроанатомическом уровне.
Этот метод обладает значительным потенциалом для исследований, требующих детальной фенотипической характеристики ex vivo небольших образцов, таких как эмбрионы мышей, которые широко используются в экспериментальных схемах6. Йодный контраст в сочетании с микрокомпьютерной томографией был использован для получения объемных количественных оценок органов7 и ориентирных трехмерных (3D) структур 8,9. В последние годы для описания фенотипических особенностей головного мозга грызунов10 применяется микрокомпьютерная томография окрашенных образцов, и были предложены различные усовершенствования методики. Было обнаружено, что для мозга взрослого человека протокол 48-часового погружения в йод с предшествующей стадией перфузии гидрогелем позволяет получать изображения высокого качества11. Gignac et al.12 расширили пределы этого метода, показав, что мозг крыс, окрашенный йодом, может быть обработан для выполнения рутинных гистологических методов. Аналогичным образом, эти процедуры демонстрируют многообещающие результаты для мозга эмбрионов и грызунов до отъема 8,13,14,15.
Несмотря на то, что нейробиология в основном применяет методы, основанные на микроскопе, для оценки различных структурных и функциональных аспектов развития мозга, такие исследования больше подходят для характеристики конкретных клеточных популяций или пространственно ограниченных структур. И наоборот, микро-КТ позволяет описывать целые структуры и получать 3D-модели, которые сохраняют соответствующую пространственную информацию, что является дополнением к микроскопическим методам. Магнитно-резонансная томография (МРТ) также является стандартным методом, применяемым для изучения структурных особенностей мелких животных 16,17,18. Тем не менее, микро-КТ с использованием контрастного вещества имеет два основных преимущества для фиксированных образцов ex vivo: микро-КТ-сканеры в значительной степени дешевле и просты в эксплуатации, а также обеспечивают более высокое пространственное разрешение, чем МРТ12.
Целью данной работы является описание процедуры получения изображений мозга новорожденных мышей с высоким разрешением с помощью микрокомпьютерной томографии после окрашивания раствором Люголя, контрастным веществом на основе йода. Представлен комплексный протокол, который начинается с предварительных этапов, таких как забор образцов и фиксация тканей, и проходит через окрашивание, получение микро-КТ изображений и стандартную обработку. Обработка изображений включает в себя сегментацию 3D-объема всей головы, а также мозга и выбор конкретных анатомических плоскостей для оцифровки координат точек, которые затем могут быть использованы в морфометрическом анализе. Несмотря на то, что основное внимание здесь уделяется мозгу новорожденных мышей, аналогичные стратегии могут быть применены и к другим мягким тканям. Таким образом, представленный здесь протокол является достаточно гибким, чтобы его можно было применять, с незначительными изменениями, к другим типам образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными.
1. Отбор и подготовка проб
- Приготовьте 500 мл 4% параформальдегида (PFA).
- Под флюсом для экстракции в шкафу добавьте 20 г порошка PFA к 250 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) в стеклянном стакане объемом 1 л. Поместите стакан с магнитом на магнитную пластину для перемешивания.
- Помешивайте при нагревании. С помощью термометра постоянно проверяйте температуру раствора, чтобы она не превышала 60 °C.
- С помощью пластиковой пипетки Пастера добавьте в раствор капли 1 М NaOH для растворения PFA. После того, как порошок PFA полностью растворится, охладите раствор при комнатной температуре (RT).
- Отрегулируйте объем до 500 мл с помощью 1x PBS. Доведите рН до 7,2-7,3, добавив капли 1 M HCl с помощью пластиковой пипетки Пастера.
- С помощью бумажного фильтра и стеклянной воронки отфильтруйте раствор в стеклянной бутылке объемом 1 л.
- Закройте стеклянную бутылку, выньте ее из шкафа для флюса и храните в холодильнике при температуре -4 °C.
- Соберите образцы мозга.
- Чтобы получить образцы, новорожденных мышей-жертв на следующее утро после рождения, в возрасте 0,5 дня (P 0,5), обезглавливают их хирургическими ножницами.
- Поместите ножницы в шею новорожденного, придерживая тело, и выполните одиночный и чистый разрез.
- Зафиксируйте образцы в PFA.
- Наполните коническую пробирку объемом 50 мл 40 мл 4% PFA.
- Погрузите каждую головку в пробирку, содержащую PFA в качестве фиксирующего агента. Для этого действия используют шпатель или ложку Патона.
- Храните конические пробирки в холодильнике при температуре -4 °C в течение 48 часов, затем перейдите на 40 мл 1x PBS с 0,1% азидом натрия в качестве консерванта. Хранить в холодильнике при температуре -4 °C.
2. Окрашивание образца
- Приготовьте раствор Люголя (3,75% масс.).
- Под экстракционным флюсом в шкафу, в стеклянном стакане объемом 1 л, растворяют 10 г Kl и 5 гI2 в 400 мл дистиллированной воды, при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки.
- Погрузите каждую головку в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 40 мл раствора Люголя.
- Для новорожденных с приблизительным размером тела 1,3 г образцы оставляют погруженными на 15-20 ч с постоянным перемешиванием с помощью орбитального шейкера.
- Перед сканированием образцы помещают в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл 1% агарозы, на 30 мин.
3. Микро-КТ сканирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Для микрокомпьютерной томографии требуется специальное оборудование. Существуют различные варианты такого рода сканеров, и детали приобретения зависят от характеристик используемого оборудования. Лаборатория доктора Халльгримссона рассчитывает на некоторые альтернативы микрокомпьютерным томографам. Здесь протокол основан на использовании базового настольного сканера, который является одним из наиболее доступных аппаратов для визуализации мелких животных, используемых лабораториями по всему миру. Если объектом сканирования является череп, пропустите шаги, описанные в разделе 2 протокола, и перейдите к разделу 3. После сканирования черепа можно было провести процесс окрашивания и сканирование мозга для получения изображений с одних и тех же образцов мозга и черепа.
- Поместите образец в держатель для микро-КТ.
- Поместите образец в коническую пробирку объемом 50 мл. Зафиксируйте образец, чтобы избежать движений во время сеанса сканирования. Для этой цели можно использовать полиуретановый материал для заполнения пустых частей трубки.
- Откройте оборудование и поместите пробирку с образцом в держатель микро-КТ.
- Войдите в панель управления микро-КТ и зарегистрируйте образец для сканирования. При этом автоматически будет сгенерирован номер образца. Кроме числа, заполните поле «Имя». Имя и номер образца должны быть записаны в другом месте (например, в электронной таблице) на случай, если необработанные данные потребуется получить снова.
- Запустите программу сканирования. Введите название или номер образца и выберите Управляющий файл, который должен содержать параметры сканирования.
- Отсканируйте образец.
- На экране программного обеспечения micro-CT задайте следующие параметры: размер изотропного вокселя 0,012 мм, 45 кВпик, 177 лА, время интегрирования 800 000 мс и 500 проекций на 180°.
- Задайте область сканирования, выбрав Scout View. Как только появится опорное изображение, нажмите кнопку Опорная линия , чтобы задать область. Переместите сплошную зеленую линию к краю образца, затем, удерживая нажатой клавишу Shift , перетащите курсор, чтобы продлить область сканирования до другого края образца.
- Нажмите кнопку ОК , чтобы начать сканирование.
- Оцените и экспортируйте скан.
- Откройте программу оценки микрокомпьютерного томографа и нажмите « Выбрать образец и измерение». В поле Фильтр введите имя образца, выберите образец и выберите файл измерения.
- Файл будет загружаться в виде срезов, количество которых зависит от начального окна сканирования. Нажмите кнопку «Загрузить все », которая загрузит каждый фрагмент и облегчит перемещение между фрагментами в дальнейшем.
- Выберите «Задачи» > «Оценка 3D», чтобы инициализировать рамку обрезки вокруг фрагментов. Появится запрос на 3D-оценку с несколькими полями, включая Task/Evaluation, VOI (Volume of Interest), Start X, Y, Z и Dimension X, Y, Z.
- Задайте для поля Задача > Оценка 3D соответствующий сценарий, так как можно выполнять различные задачи оценки, такие как реконструкция, сегментация, морфометрия (например, минеральная плотность костной ткани), а также преобразование или перенос файлов. В качестве руководства можно использовать сценарий оценки по умолчанию .
- После выбора сценария отрегулируйте поле VOI на основном изображении. Начните с первого среза. Убедитесь, что коробка содержит анатомию, которую необходимо оценить. Переместите VOI, щелкнув правой кнопкой мыши по одному из маленьких белых квадратов по направлению к краю прямоугольника и изменив размер VOI с помощью средней кнопки мыши. Кроме того, можно настроить поля измерений в числовом выражении.
- Пройдитесь по образцу с помощью полосы прокрутки под изображением, чтобы убедиться, что все анатомические элементы были зафиксированы в поле VOI. Нажмите на XY, XZ или YZ в левом верхнем углу программы, чтобы изменить ориентацию.
- Выберите Начать оценку. В зависимости от сценария оценки задачи, будет сгенерирован файл 3D-изображения .aim с соответствующим заголовочным файлом .txt. Кроме того, в скрипте может быть указан путь к файлу File Transfer Protocol (FTP) образа в определенное место.
4. Обработка изображений
- Откройте изображения в программном обеспечении для обработки изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка изображений может осуществляться с помощью различного программного обеспечения. Этот протокол включает в себя основные шаги в коммерческом программном обеспечении, которое широко распространено в этой области и имеет универсальные инструменты для базовой и расширенной обработки. Кроме того, существуют различные допустимые форматы для реконструированных микро-КТ изображений. Этот аспект обычно зависит от оборудования, используемого для сбора данных, и его программного обеспечения. Здесь обработка изображений осуществляется с .bmp изображениями. Такая же процедура может быть применена для .tiff изображений и других типов. Поскольку сбор данных осуществляется в сканере с форматом .aim в качестве формата по умолчанию, сначала представляется преобразование из .aim в .bmp.- Чтобы открыть AIM-файлы, выберите Файл > Открыть данные и выберите файл. После этого откроется окно с заголовком «Выбор формата файла». Выберите Необработанные данные.
- Откроется окно с заголовком Параметры сырых данных. В этом окне заполните параметры, следующие за информацией о заголовочном файле .txt, который генерируется для каждого файла .aim. В поле Тип данных выберите 16-битный заголовок с числом после Данные изображения начинаются со смещения байта. Кроме того, задайте размеры и размер воксела, используя информацию в заголовке .txt файла. После заполнения параметров нажмите кнопку ОК.
- Если необходимо преобразование из .aim в .bmp, на главной панели > в виде проекта щелкните правой кнопкой мыши по объекту .aim и выберите опцию Convert > Convert Image Type. В разделе Свойства выберите 8-битный в качестве Типа вывода. Выберите Применить.
- Щелкните правой кнопкой мыши по новому 8-битному объекту. Выберите Сохранить как. Выберите .bmp и сохраните.
- Чтобы открыть .bmp файл, выберите Файл > Открыть данные и выберите файл. После этого откроется окно с параметрами изображения. Подтвердите параметры и подтвердите, если они верны.
- На главной панели > в виде проекта создается новый объект с именами .bmp файлов. Щёлкните правой кнопкой мыши по этому объекту и выберите опцию Ortho Slice. В окне "Свойства" выберите номер среза и плоскость ориентации для просмотра.
- Получите 3D-объемы всей головки.
- На главной панели > в виде проекта щелкните правой кнопкой мыши по объекту изображения. Выберите параметр «Интерактивное пороговое значение» > «Создать». В окне «Свойства» изменяйте значения параметров «Минимальный RGB» и «Максимальный RGB» до тех пор, пока не будет выбрана часть изображения, соответствующая голове животного. Выберите Применить.
- На Главной Панели > Виде Проекта создается пороговый объект. Щелкните правой кнопкой мыши на этом объекте и в Свойствах выберите Isosurface. В окне "Свойства" выберите пороговое значение для визуализации поверхности и нажмите кнопку "Применить". Этот порог должен быть выбран опытным путем, затем, возможно, потребуется изучить различные значения.
- Оцифровка координат точек
- 3D-координаты точек могут быть оцифрованы как на основе срезов, так и на основе извлеченных поверхностей. Для первого варианта щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите Фрагмент. В разделе «Трансвести» выберите нужный срез в осевой плоскости. Если плоскость размещена неправильно, нажмите кнопку "Параметры" > "Поворот " в окне "Свойства" , чтобы задать правильную ориентацию.
- Чтобы оцифровать ориентиры, щелкните правой кнопкой мыши на главной панели > виде проекта и выберите Создать объект > точек и линий > ориентиров. Щелкните правой кнопкой мыши новые ориентиры объекта и выберите "Вид ориентира". В окне "Вид ориентира" измените размер точки в поле "Размер". Чтобы добавить ориентиры в Свойства, используйте опцию Добавить в режиме редактирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для новорожденных ранее был опубликован набор ориентиров и полуориентиров вокруг аксиальных и сагиттальных кривых головного мозга14. - Во-первых, выберите осевую плоскость, которая пересекает самую ростральную точку обонятельных луковиц и самую каудальную точку коры головного мозга.
- Выберите Ориентиры объекта и в разделе Свойства выберите Редактор ориентиров. С помощью стрелки нажмите на место, где точка должна быть оцифрована.
- В предложенном наборе ориентиров оцифрованы 24 точки в выбранной осевой плоскости. Оцифруйте первую в самой каудальной точке мозга на средней линии.
- Оцифруйте пять точек, равномерно распределенных по кривой (полуориентиры), до следующего ориентира на пересечении среднего мозга и коры.
- Затем оцифруйте восемь точек (полуориентиров) вокруг коры головного мозга.
- Оцифруйте новый ориентир на пересечении коры головного мозга и обонятельных луковиц. Затем оцифруйте четыре точки (полуориентиры) вокруг обонятельных луковиц.
- Оцифруйте новый ориентир в самой ростральной точке обонятельных луковиц на средней линии. Затем оцифруйте две точки (полуориентиры) между обеими обонятельными луковицами.
- Оцифруйте новый ориентир в самой каудальной точке обонятельных луковиц на средней линии.
- Для сагиттальных точек сделайте срез в правой части мозга в парасагиттальной плоскости, где мозг наиболее выпукл.
- В предложенном наборе ориентиров оцифрованы 33 точки в выбранной парасагиттальной плоскости. Оцифруйте первый в месте пересечения промежуточного и заднего мозгов. Затем оцифруйте девять точек (полуориентиров) в вентральной границе мозга.
- Оцифруйте новый ориентир в самой ростральной точке обонятельной луковицы. Затем оцифруйте три точки (полуориентира) вокруг обонятельных луковиц.
- Оцифруйте новый ориентир на пересечении обонятельной луковицы и коры головного мозга. Затем оцифруйте три точки (полуориентира) вокруг обонятельных луковиц.
- Оцифруйте новый ориентир на пересечении обонятельной луковицы и коры головного мозга. Затем оцифруйте семь точек (полуориентиров) вокруг коры головного мозга.
- Оцифруйте новую веху на пересечении коры и среднего мозга. Затем оцифруйте семь точек (полуориентиров) вокруг коры головного мозга.
- Оцифруйте новую веху на пересечении коры и среднего мозга. Затем оцифруйте шесть точек (полуориентиров) вокруг среднего мозга.
- Оцифруйте новый ориентир на пересечении среднего мозга и мозжечка. Затем оцифруйте две точки (полуориентиры) вокруг мозжечка.
- Оцифруйте новый ориентир на пересечении мозжечка и заднего мозга.
- Сохраните оцифрованные точки. Щелкните правой кнопкой мыши по Object Landmarks и выберите опцию Save Data.
- Проанализируйте координаты точки.
ПРИМЕЧАНИЕ: После оцифровки координат точек для набора образцов можно выполнить базовый анализ с помощью инструментов геометрической морфометрии для получения переменных размера (размер центроида) и формы (координаты формы или Прокрустова). Анализ проводится в свободной открытой программной среде, которая особенно подходит для статистического анализа.- С помощью блокнота создайте файл, содержащий координаты всех оцифрованных образцов. Для этого следуйте формату TPS, как описано в https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm.
- Откройте статистическое программное обеспечение. Выберите Файл > Изменить каталог , чтобы выбрать каталог, в котором будет сохранен TPS-файл.
- Выберите Пакеты > Установить пакеты. Выберите одно крановое зеркало. Найдите геоморф и установите его.
- Загрузите пакеты, набрав в консоли: library(geomorph) и library(Morpho).
- Загрузите набор данных, введя в консоли: dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID").
- Выполните обобщенный прокрустов анализ, набрав в консоли: GPA<- gpagen(dataset).
- Чтобы получить размер центроида, введите в консоли: CS<-GPA$Csize.
- Получите прокрустовы координаты, набрав в консоли: ProcCoord<- GPA$coords.
- Постройте график координат Прокруста и средней формы, введя в консоль: plotAllSpecimens(ProcCoord).
- Сегментация ROI
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сегментировать мозг и получить 3D-реконструкцию, вручную определите ткани мозга в каждом срезе. Та же процедура может быть применена к конкретным показателям ROI, таким как обонятельные луковицы, кора головного мозга и т. д.- Щелкните правой кнопкой мыши на Main Panel > Project View и выберите Create Object > Label Field.
- Выбрав объект Label Field , нажмите кнопку Segmentation Editor в Properties.
- В разделе «Материалы» добавьте новый материал и, при необходимости, переименуйте его в «Мозг».
- В разделе «Выделение» выберите опцию «Текущий срез», чтобы сегментировать ткань, соответствующую мозгу, в каждом срезе.
- Используя параметры, представленные в разделе «Инструменты», выделите ткань мозга в каждом срезе. Для этого случая больше всего подойдут Волшебная палочка и Кисть .
- После того, как выделение будет сделано в каждом фрагменте, нажмите кнопку Добавить в выделенную область.
- Когда выделение во всех фрагментах будет завершено, вернитесь в Project View на главной панели и щелкните правой кнопкой мыши на Label Field , чтобы выбрать Generate Surface, затем нажмите Apply.
- После того, как поверхность получена, экспортируйте ее, применив команду Извлечь поверхность.
- Чтобы получить объем сегментированных структур, на главной панели > виде проекта выберите объект, содержащий метку, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Измерить и проанализировать > объемную долю". Затем нажмите кнопку Применить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представлен базовый протокол получения изображений мозга новорожденных мышей с высоким разрешением. Головы сканировали после погружения в раствор Люголя. Несмотря на небольшие размеры, можно выделить основные анатомические структуры мозга, такие как обонятельные луковицы, кора, средний мозг, мозжечок и задний мозг (рис. 1).
Используя эти изображения в качестве входных данных, можно проводить различные анализы. Был оцифрован набор ориентиров и полуориентиров в двух разных анатомических плоскостях. Как видно на рисунке 2, точки расположены по всей границе мозга в выбранных плоскостях. После завершения оцифровки координаты точек могут быть прочитаны в .txt файле (рис. 3). Целью точечной оцифровки было получение необработанных координат, которые в дальнейшем могут быть использованы в геометрическом морфометрическом анализе. Представленный протокол ориентирован на один образец, а морфометрический анализ подходит для более крупных образцов, но результаты, полученные с использованием того же набора точек, представлены в другом месте14.
Наконец, результатом ручной сегментации всего мозга является 3D-модель мозга (рис. 4). В этих томах могут быть использованы различные подходы, от простой оценки их площади и объема до извлечения точек поверхности и выполнения анализа, аналогичного тому, который представлен здесь для точек кривых.
Рисунок 1: Репрезентативные срезы микро-КТ изображения головы новорожденного. (A-C) Аксиальная, (D) корональная и (E) парасагиттальная плоскости. Области и структуры, которые можно различить в парасагиттальной плоскости: (а) обонятельные луковицы, (б) кора, (в) средний мозг, (г) мозжечок, (д) задний мозг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Ориентиры и полуориентиры, оцифрованные в предлагаемом протоколе. (A) Представлены осевая и (B) парасагиттальная плоскости. Цифры обозначают ориентиры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пример файла, содержащего координаты точек, экспортированных из программного обеспечения. Указаны основные пункты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: 3D-реконструкция мозга новорожденного после ручной сегментации. Пример целого реконструированного мозга представлен в двух видах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной работе представлен краткий протокол сканирования тканей головного мозга новорожденных мышей с помощью микро-КТ с контрастным веществом. Кроме того, он включает в себя простые процедуры для получения количественных и качественных результатов. На основе этих методов могут быть проведены дополнительные альтернативные или дополнительные анализы.
Как показано в протоколе, микро-КТ изображения могут быть проанализированы различными способами. В предыдущих исследованиях наша группа оценивала вариации размеров и формы перинатального мозга мышей путем оцифровки координат точек и применения геометрических морфометрических методов 8,14. Оцифровка координат также полезна для получения линейных измерений с использованием простой оценки евклидовых расстояний. Это, вместе с объемами, полученными в результате сегментации мозга и ROI, является ценными исходными данными для традиционной морфометрической оценки.
Несмотря на то, что представленный здесь протокол легко применим к небольшим образцам ex vivo , таким как те, которые мы использовали, он не применим для исследований in vivo , так как фиксация, и особенно раствор Люголя в качестве контрастного вещества, нежизнеспособны. Микрокомпьютерная томография используется in vivo, как правило, для исследования твердых тканей19, но введение контрастных веществ, которые достигают мозга, пересекая гематоэнцефалический барьер у живых новорожденных, является непростым делом. Таким образом, представленная здесь методика по-прежнему является перспективным инструментом для ответа на различные вопросы морфологической изменчивости.
С тех пор, как новаторские исследования показали, что йод является хорошим выбором для эмбрионов позвоночных20, его применение быстро расширилось, и стало очевидно, что одним из основных недостатков этого метода является усадка, производимая контрастным веществом12. Это повсеместная проблема в исследованиях, использующих этот подход, и пользователи должны учитывать ее при воспроизведении представленного здесь протокола, поскольку ожидается некоторое сокращение объема. Для уменьшения этого эффекта были предложены различные стратегии; Vickerton et al.21 исследовали различные концентрации йода и пришли к выводу, что усадка напрямую зависит от концентрации, и ее снижение в значительной степени помогает сдерживать деформацию из-за этого эффекта. Еще одним моментом, который необходимо скорректировать, является правильное время погружения, которое зависит от размера и твердости конструкций. Проведя ряд тестов, мы установили, что 15-20 ч – достаточный срок для окрашивания тканей мозга новорожденных мышей и сохранения основных морфологических свойств. Некоторые авторы предлагают перед окрашиванием использовать некоторые растворы, такие как агарозный7 и гидрогель11,13, или применение буферного раствора Люголя, предотвращающего закисление и, следовательно, усадку22. Все эти процедуры могут быть добавлены к протоколу, представленному здесь, который является общим и базовым подходом к микро-КТ визуализации с йодным контрастированием.
Использование микрокомпьютерных томографов для визуализации мягких тканей в более крупных образцах, таких как взрослые мыши, имеет некоторые недостатки. Процедура погружения для окрашивания не рекомендуется, потому что распределение контрастного вещества, вероятно, будет неоднородным. Будет важно изучить некоторые альтернативные варианты, такие как введение раствора Люголя через сердечную перфузию.
В заключение следует отметить, что микро-КТ с добавлением раствора Люголя является подходящей альтернативой для визуализации перинатального мозга мелких животных, в частности мышей. Это простой способ получения изображений с высоким разрешением, которые, дополненные гистологией, могут обеспечить последовательную характеристику морфологической изменчивости мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Благодарим Вэй Лю за техническую помощь. Эта работа финансируется ANPCyT PICT 2017-2497 и PICT 2018-4113.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
References
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660 (2021).
- Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
- Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
- de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227 (2016).
- Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
- Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Gignac, P. M., O'Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
- Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184 (2022).
- Turnbull, D. H., Mori, S.
- Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615 (2018).
- Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
- Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol's solution. Scientific Reports. 11, 19781 (2021).
